环二核苷酸分子（CDNs）及其衍生物是干扰素刺激蛋白（STING）的主要配体。然而，CDNs类分子的负电荷高、稳定性差等特点导致其生成药性不足和生物利用效率低，严重限制其临床应用。尽管纳米材料被广泛用于CDNs的胞质递送体系的设计，但其载药能力可能不足，且其成分复杂、生物安全性风险等问题一定程度限制了CDNs胞质递送体系的临床转化。据此，清华大学李艳梅教授课题组设计了一种无纳米载体的CDNs胞质递送策略，即在过量K+存在的情况下，含G碱基的CDNs 形成寡聚体，并进一步与多价金属离子自组装形成CDNs纳米颗粒（CDN NPs）。CDN NPs不需要使用纳米载体即可实现CDNs的胞质递送，还可以通过重塑免疫抑制性肿瘤微环境、诱导肿瘤免疫原性细胞死亡、增加肿瘤浸润性淋巴细胞比例和诱导肿瘤抗原特异性T细胞反应等多种方式增强肿瘤免疫治疗效果。CDN NPs与免疫检查点阻断剂anti-PD-1的联用可进一步放大实体瘤的免疫治疗效果。
背景介绍：
STING 信号通路在抗肿瘤、抗病毒免疫治疗中发挥了关键作用。STING 通路的激活能通过重塑免疫抑制性肿瘤微环境和增加淋巴细胞向肿瘤组织的浸润等方式来增强肿瘤的免疫原性，而肿瘤细胞内源性 STING 信号通路激活可引起肿瘤的免疫原性细胞死亡（ICD），会进一步增加肿瘤的免疫原性。环二核苷酸（CDNs，如 2’,3’-cGAMP、CDG、CDA、3’,3’-cGAMP）是 STING 的天然配体和激动剂，CDNs 与 STING 结合后激活 STING 蛋白及下游信号，并引起 I 型干扰素 （IFN-I）的表达，从而诱导树突状细胞（DCs）的成熟、活化以及 T 细胞免疫反应的产生。然而，CDNs 易被磷酸二酯酶降解，且细胞膜渗透效率低、成药性差，给其临床应用带来了挑战。为了解决这些问题，纳米材料辅助的 CDNs 体内递送有望提升 CDNs 的生物利用效率，改善其成药性和免疫治疗效果。常见的 CDNs 纳米递送体系包括脂质体、聚合物纳米颗粒、水凝胶及金属配合物纳米颗粒等。然而，部分纳米载体成分复杂、生物安全性不足，且对 CDNs 的负载能力低、释放不充分，在疾病治疗应用中往往需要较高的给药剂量。因此，如果 CDNs能够在无纳米载体辅助的情况下自组装形成纳米颗粒并完成胞质递送和释放，不仅有利于提升 CDNs 的载药量，还能规避传统纳米载体的可能风险，提高 CDNs 用药的安全性和生物利用率。
本文亮点：
有研究发现，一些一价金属离子（如 K+）能诱导含 G 碱基 CDNs 形成寡聚体，但这些 CDN 寡聚体并不能继续发生纳米尺度的自组装过程。考虑到 CDN寡聚体结构的对称性、亲水性以及高负电性，这些CDN 寡聚体有望作为基本单元，与一些多价金属离子通过静电相互作用、配位作用等方式进行自组装而形成纳米颗粒。清华大学李艳梅教授课题组基于CDNs寡聚体与多价金属离子之间的多种作用方式，发展了一种无纳米载体辅助的CDNs胞质递送策略（CDN NPs），这种策略规避了纳米载体的使用，制备流程简洁、高效，具有广阔的肿瘤免疫治疗应用前景（图1）。
图1. CDN NPs 的设计及其肿瘤免疫治疗应用
有趣的是，一些常见的多价金属离子（如Mg2+、Ca2+、Zn2+、 Mn2+、Cu2+、Co2+、Ni2+等）本身拥有免疫调节功能，且这些金属离子常被用于金属-核酸复合物的构建，以促进核酸分子的胞质递送。作者首先从金属离子的免疫刺激活性、金属离子与CDG（CDNs的一种代表结构）寡聚体的组装性质及组装颗粒的免疫刺激活性等方面对上述金属离子进行了筛选，并发现Mn2+最适合于CDG NPs的制备。物化性质表征结果表明CDG NPs的组装尺寸均一且稳定。能谱分析（EDS）结果显示Mn2+/P的比值约为0.8，换算为Mn2+/CDG的比值为1.6，推测CDG寡聚体与Mn2+之间同时存在静电相互作用和配位作用（图2）。
图2. 金属离子的筛选及CDG NPs的物化性质表征
免疫细胞活化评价结果表明，相比于单独的CDG、单独的Mn2+，及CDG和Mn2+的物理混合物（CDG+Mn2+），CDG NPs可显著增强抗原提呈细胞（APCs）的活化，且该活化效果依赖于STING通路的激活。作者利用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）和具有EDS的场发射扫描电子显微镜（ FE-SEM/EDS ）对CDG NPs的细胞摄取进行评价，结果显示，巨噬细胞J774A.1对CDG NPs的摄取量远高于单独的CDG及CDG与Mn2+的物理混合物（CDG+Mn2+），证明CDG NPs增加了细胞对CDG的摄取效率。此外，LSCM结果还表明，细胞内吞的CDG NPs最终定位到了溶酶体，推测这可能有利于CDG的酸性pH响应释放。作者用HPLC方法分析了CDG NPs在不同pH的醋酸-醋酸钠缓冲介质中的CDG释放量，证实了CDG NPs的酸性pH响应性质，为溶酶体介导的CDG释放提供了证据（图3）。
图3. CDG NPs 的免疫刺激活性及细胞摄取
CDG NPs 的优异免疫细胞刺激活性显示了其潜在的肿瘤免疫治疗应用前景。对此，作者探索了CDG NPs对黑色素瘤B16-F10的免疫治疗效果。CDG NPs通过瘤内给药方式对B16-F10荷瘤小鼠进行三剂免疫后，小鼠肿瘤的生长得到了显著的抑制，最终有5/8小鼠的肿瘤发生完全消退。接受过CDG NPs免疫的无瘤生存小鼠，经B16-F10细胞的再次种植，仍有80%小鼠对肿瘤形成产生了抵抗作用，证明CDG NPs的瘤内给药使小鼠产生了针对B16-F10肿瘤的长期免疫记忆（图4）。随后，为了拓展CDG NPs的免疫治疗应用，作者将其与免疫检查点anti-PD-1（即αPD-1）进行联用，对小鼠结肠癌MC38的治疗效果进行了探索。结果表明，CDG NPs+αPD-1联用（CDG NPs通过瘤旁皮下给药、αPD-1通过腹腔给药）可进一步放大MC38肿瘤的免疫治疗效果，比单独的CDG NPs和单独的αPD-1具有更明显的优势。以上结果证明，CDG NPs单独给药或联合免疫检查点给药均可促进小鼠实体瘤的消退，对于提升小鼠的生存质量具有重要意义。
图4. CDG NPs 单独（虚线上）或联合anti-PD-1（虚线下）给药用于小鼠肿瘤的免疫治疗
为了更好地了解CDG NPs的肿瘤免疫治疗效果，作者对CDG NPs介导的肿瘤免疫机制进行了深入研究。首先，CDG NPs的免疫治疗改善了肿瘤微环境，使得免疫抑制性细胞（如调节性T细胞Treg、肿瘤相关巨噬细胞M2-TAMs）明显减少，而CD8+ T细胞与Treg的比例明显增加，说明CDG NPs有利于营造促炎性肿瘤免疫微环境（图5 a-c）。一般来说，CDG NPs瘤内给药后，一方面可直接作用于免疫系统，另一方面可对肿瘤细胞产生直接影响。作者发现，CDG NPs在体外层面可诱导肿瘤免疫原性细胞死亡，相应的标志物如钙网蛋白（CRT）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和ATP的产生量均明显增加；通过瘤内给药后，CDG NPs使得肿瘤组织的CRT表达量显著上调，进一步证实了CDG NPs可诱导肿瘤免疫原性细胞死亡。这可能是因为肿瘤细胞摄取CDG NPs，进而激活肿瘤内源性STING通路导致的，这一结果说明CDG NPs有利于增强肿瘤的免疫原性，对于激发抗肿瘤免疫十分重要（图5 d-h）。进一步，作者发现CDG NPs免疫治疗后，荷瘤小鼠的脾脏T细胞产生了针对肿瘤抗原的特异性免疫反应，说明CDG NPs可诱导抗肿瘤适应性免疫反应，而不仅局限于诱导固有免疫反应（图5 i-l）。此外，通过对荷瘤小鼠的肿瘤浸润性T细胞的分析，作者发现CDG NPs免疫治疗后，肿瘤浸润性T细胞的比例提升了2-67倍，这说明CDG NPs可改善肿T细胞的瘤组织浸润能力（图5 m-p）。以上结果表明，CDG NPs给药有利于促进肿瘤免疫循环（肿瘤免疫原性提升—肿瘤抗原的释放与摄取—肿瘤抗原特异性T细胞免疫反应—肿瘤抗原的进一步释放）的形成。
图5. CDG NPs 通过多种免疫机制诱导抗肿瘤免疫反应：a-c, 免疫抑制性肿瘤微环境重塑；d-h,肿瘤免疫原性细胞死亡；i-l, 肿瘤抗原特异性T细胞免疫反应；m-p, T细胞的肿瘤浸润
总结与展望：
综上所述，本文设计的无纳米载体的CDNs胞质递送策略可提升CDNs的细胞摄取效率，在肿瘤免疫治疗中充分展现了其优异的免疫治疗效果，显示出了广阔的临床应用前景，也为无载体CDNs胞质递送（或CDNs自递送）策略的设计提供了重要借鉴。
该工作以Research Article的形式发表在CCS Chemistry，第一作者为清华大学博士研究生赵朗，通讯作者为清华大学李艳梅教授。该技术目前已申请国家发明专利。
文章详情：
Cyclic Dinucleotide Self-Assembled Nanoparticles as a Carrier-Free Delivery Platform for STING-Mediated Cancer Immunotherapy
Lang Zhao, Shao-Hua Zhuo, Tian-Yang Wang, Jun-Jun Wu, Jing-Yun Su, Wen-Hao Li, Bo-Dou Zhang, Yan-Mei Li*
Cite this by DOI:
10.31635/ccschem.023.02751
文章链接：
/10.31635/ccschem.023.02751
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清华大学李艳梅教授团队：基于环二核苷酸自组装纳米颗粒的无载体递送平台用于STING介导肿瘤免疫治疗
