本发明涉及细胞成像研究所用荧光开关体系领域，具体涉及一种聚噻吩衍生物阳离子/全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子静电复合物的荧光开关体系、制备方法及应用。
背景技术：
荧光成像技术在生物领域有广泛应用，可以用于细胞成像、组织成像和生命过程研究。但传统的荧光成像技术存在易受背景荧光干扰，与样品的自发荧光难以区分等问题。荧光开关技术的出现解决了这一问题，通过调控标记分子的荧光处于打开或者关闭的状态，被标记分子的位置被显而易见地从背景和自发荧光中分辨出来。基于荧光开关技术，近年来还发展出了超分辨荧光显微技术，突破了光学显微镜的分辨率极限。
常用的荧光开关体系的构建涉及两个部分，即荧光产生单元和荧光调控单元，常见的荧光产生单元有荧光蛋白，小分子染料，量子点和共轭聚合物，其中以共轭聚合物具有高亮度和较好的光稳定性而脱颖而出。光调控单元有各类具有光异构能力的分子，如螺吡喃、二芳基乙烯、俘精酸酐等，其中二芳基乙烯具有优异的热稳定性和强抗疲劳性而成为最优选择。
常见的连接荧光开关两个部分的方法有共价连接和再沉淀法制备纳米粒子的方法，这两个方法都需要繁琐的制备过程，阻碍了荧光开关体系的广泛应用，因此急需一种简单制备荧光开关纳米粒子的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术存在的聚噻吩/二芳基乙烯的荧光开关体系制备繁琐的问题，提供一种聚噻吩衍生物阳离子/全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子静电复合物的荧光开关体系、制备方法及应用，该聚噻吩衍生物阳离子/全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子静电复合物的荧光开关体系具有细胞穿透率强，在细胞成像中具有选择性标记指定细胞的功能，并且制备方法简单、普适性强。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种荧光开关体系，包括聚噻吩衍生物阳离子和全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子通过静电复合形成的纳米粒子，聚噻吩衍生物阳离子的结构如式(ⅰ)所示，全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子的结构如式(ⅱ)所示；
式(ⅰ)的结构为：
式(ⅱ)的结构为：
式(ⅰ)中，r选自
本发明第二方面提供一种荧光开关体系的制备方法，该制备方法包括将荧光产生单元和荧光调控单元在溶液中进行静电复合；所述荧光产生单元选自聚噻吩阳离子、聚噻吩阴离子、聚噻吩衍生物阴离子或者聚噻吩衍生物阳离子，所述荧光调控单元选自全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子或者全氟环戊烯型二芳基乙烯阳离子，所述荧光开关体系中荧光产生单元和所述荧光调控单元所带电荷相反。
本发明第三方面提供一种荧光开关体系在细胞成像中的应用。
本发明第四方面提供一种荧光开关体系在hela细胞和mcf-7细胞成像中的应用。
采用以上方法制得的聚噻吩衍生物阳离子/全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子的荧光开关纳米粒子的平均粒径为200-400nm(优选300nm)，该荧光开关纳米粒子具有较好的细胞穿透能力。本发明提供的荧光开关体系的制备方法简单，具有普适性。聚噻吩衍生物阳离子/全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子所形成的荧光开关体系在细胞成像中具有选择性标记指定细胞的功能。上述方法制得的荧光开关体系在紫外光存在下荧光减少，所述荧光开关体系在可见光存在下荧光恢复，实现荧光开关。
附图说明
图1是实施例1中pt/daeona荧光开关体系所形成的纳米粒子的粒径分布图；
图2是实施例1中pt/daeona荧光开关体系的荧光开关效果图(荧光谱的变化)；
图3是实施例1中pt/daeona荧光开关体系的纳米粒子在562nm处的荧光开关效果图(最大发射值与循环次数的关系图)；
图4是对比例4制得纳米粒子荧光开关效果图(荧光谱的变化)；
图5是对比例4制得纳米粒子在562nm处的荧光开关效果图(最大发射值与循环次数的关系图)；
图6是实施例1中pt/daeona荧光开关体系所形成的纳米粒子用于hela细胞的荧光开关效果图；
图7是实施例1中pt/daeona荧光开关体系所形成的纳米粒子用于hela细胞的选择性点亮效果图；
图8是实施例1中pt/daeona荧光开关体系所形成的纳米粒子用于mcf-7细胞的荧光开关效果图；
图9是实施例1中pt/daeona荧光开关体系所形成的纳米粒子用于mcf-7细胞的选择性点亮效果图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明第一方面提供一种荧光开关体系，包括聚噻吩衍生物阳离子和全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子通过静电复合形成的纳米粒子，聚噻吩衍生物阳离子的结构如式(ⅰ)所示，全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子的结构如式(ⅱ)所示；
式(ⅰ)的结构为：
式(ⅱ)的结构为：
式(ⅰ)中，r选自
根据本发明，荧光开关体系为由阴、阳荧光离子依靠静电复合制得的纳米粒子。其中阳离子可选择如式(ⅰ)结构所示的聚噻吩衍生物阳离子，该聚噻吩衍生物阳离子以3-羟基乙烷噻吩为原料聚合制得，m为70-150，优选为70-100。
若聚合度太低，产生荧光的稳定性较差，若聚合度太高，聚噻吩衍生物阳离子不能充分溶于水中。此外，聚噻吩衍生物阳离子还需与阴离子光谱匹配，以实现荧光共振能量转移。其中光谱匹配是指阴离子的一个开关状态下的吸收光谱与阳离子的发射光谱重叠，而阴离子的另一开关状态下的吸收光谱与阳离子的发射光谱没有重叠。
阴离子选择全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子，结构如式(ⅱ)，其由全氟环戊烯型二芳基乙烯醛氧化制得。一个优选实施例中，全氟环戊烯型二芳基乙烯原料(dae)在琼斯试剂作用下氧化制得全氟环戊烯型二芳基乙烯酸(daeo)。之后，daeo在碱性条件下溶解形成daeo盐溶液。例如，若daeo在naoh溶液中溶解，所形成的daeo盐溶液为daeona。
采用以上方法制得的纳米粒子在水溶液中稳定存在，并且具有长期稳定的荧光强度。
优选地，式(ⅰ)中，r选自
根据本发明，式(ⅰ)为以上结构时，该噻吩衍生物阳离子与全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子的光谱匹配效果更好，并且制得纳米粒子的荧光性能更稳定。
优选地，式(ⅰ)中，m为70-150。
根据本发明，聚噻吩衍生物阳离子的聚合度在上述范围内，产生的荧光更加稳定，且易溶于水中。
优选地，纳米粒子的平均粒径为200-400nm。
根据本发明，纳米粒子在该粒径范围内，可稳定分散于溶液中，不容易团聚，具有较好的细胞穿透能力。若粒径太小，制得的荧光开关体系不稳定，若粒径太大，细胞穿透能力较弱，影响荧光开关能力。
本发明第二方面提供一种荧光开关体系的制备方法，该制备方法包括将荧光产生单元和荧光调控单元在溶液中进行静电复合；所述荧光产生单元选自聚噻吩阳离子、聚噻吩阴离子、聚噻吩衍生物阴离子或者聚噻吩衍生物阳离子中的一种，所述荧光调控单元选自全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子或者全氟环戊烯型二芳基乙烯阳离子，所述荧光开关体系中荧光产生单元和荧光调控单元各自所带电荷的电性相反。
本发明中，荧光开关体系是包括荧光产生单元和荧光调控单元的溶液体系，其中荧光产生单元是指能够产生荧光的荧光蛋白、小分子染料、量子点或者共轭聚合物。共轭共聚物具有高亮度和较好的光稳定性，优选共轭共聚物作为荧光产生单元。荧光调控单元是指具有光异构化性能的分子，例如螺吡喃、二芳基乙烯、俘精酸酐，其中，二芳基乙烯具有较好的热稳定性和强抗疲劳性能，优选二芳基乙烯作为荧光调控单元。
发明人经过多次实验验证发现，对荧光产生单元和/或荧光调控单元进行侧链取代，使得荧光产生单元和荧光调控单元带相反电荷，在溶液中，荧光产生单元和荧光调控单元通过静电吸引可形成稳定的荧光开关体系。该方法较常规的共价连接和再沉淀法相比，工艺更简化，且具有普适性。
优选地，荧光产生单元为聚噻吩衍生物阳离子、荧光调控单元为全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子；其中，聚噻吩衍生物阳离子和全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子的摩尔比为1:7-8。
本发明中，聚噻吩衍生物阳离子和全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子均预先配制成水溶液，再将二者混合，使得聚噻吩衍生物阳离子和全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子能够在水溶液中采用静电吸引方式复合。聚噻吩衍生物阳离子和全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子混合的方式没有特别的限定，只要按照上述比例混合均匀即可。聚噻吩衍生物阳离子和全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子在水溶液中按照以上投料比混合时，所形成的荧光开关体系更加稳定。
聚噻吩衍生物阳离子/全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子所形成的荧光开关体系中，聚噻吩衍生物阳离子为荧光产生单元，其具有较好的光稳定性和高亮度；全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子为荧光调控单元，其具有较好的热稳定性和强抗疲劳性。聚噻吩衍生物阳离子和全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子采用静电复合的方式形成聚噻吩衍生物阳离子/全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子荧光开关体系，该方法更简单，容易推广应用到其他荧光开关体系，并且所制备得到的聚噻吩衍生物阳离子/全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子的荧光开关体系在水溶液中更稳定，具有选择性标记指定细胞的特点。
优选地，全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子按照如下方法制备：
(1)全氟环戊烯型二芳基乙烯醛在琼斯试剂作用下进行氧化处理制得全氟环戊烯型二芳基乙烯酸；
(2)全氟环戊烯型二芳基乙烯酸溶解于碱性溶液中制得全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子。
根据本发明，全氟环戊烯型二芳基乙烯醛(即dae)可直接购买，dae只要实现侧链修饰负电荷基团(如羧基、磺酸基)即可与聚噻吩衍生物阳离子配合形成荧光开关体系。例如一个优选实施例中的dae选择[1,2-二(2-甲基-5-对醛基苯基噻吩-3-基)]全氟环戊烯，dae的丙酮溶液在冰浴的条件下加入琼斯试剂，并在室温下反应5-6h使反应完全。之后向体系中加入异丙醇淬灭琼斯试剂，除去溶剂，提纯，并使用洗脱剂洗脱，即可制得浅蓝色的固体全氟环戊烯型二芳基乙烯酸(即daeo)，例如一个优选实施例中的daeo选择[1,2-二(2-甲基-5-对羧基苯基噻吩-3-基)]全氟环戊烯。
其中，以dae的物质的量为基准，琼斯试剂加入的量为dae加入量的5-6倍。室温的温度为25-27℃，反应5-6小时。之后，异丙醇需缓慢加入体系中，并且以体系开始变成绿色保持半分钟，确定异丙醇的添加量。溶剂除去的方法没有特别的限制，例如可以采用旋蒸。提纯的方法没有特别的限制，可以是采用甲醇充分洗涤溶解固体，多次反复抽滤除去不溶固体。洗脱时，可选用硅胶柱作为洗脱柱，洗脱剂采用氯仿、甲醇和醋酸的混合物，氯仿、甲醇和醋酸的体积比为30:1:1。
采用以上方法制得的daeo固体在碱性条件下超声溶解，之后加入pbs缓冲液，制得daeo的pbs溶液。其中，碱性条件没有特别的限制，例如可以是naoh溶液或者koh溶液。超声的条件没有特别的限制，只要能够使得daeo固体在溶液中溶解即可。
pbs缓冲液为磷酸盐缓冲液，该缓冲液可以自己配置，也可以直接购买。聚噻吩衍生物阳离子(即pt)由聚噻吩侧链接枝带有季铵基团的烷基、烷氧基或者醚基即可制得。daeo的pbs溶液与pt水溶液混合均匀，即可制得聚噻吩衍生物阳离子/全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子所形成的荧光开关体系。
本发明第三方面提供一种上述的荧光开关体系在细胞成像中的应用。
本发明第四方面提供一种上述的荧光开关体系在hela细胞和mcf-7细胞成像中的应用。
上述的荧光开关体系中荧光开关比例在3以上，在水中有较强的荧光开关能力，可实现选择性点亮单细胞。上述荧光开关体系在紫外光照射后，全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子处于关环状态，荧光大幅减少；当再接受可见光照射后，全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子处于开环状态，荧光恢复，从而实现了荧光开关的效果。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，
采用动态光散射仪测试制得荧光开关体系中纳米粒子的dls粒径分布。
荧光开关体系的荧光强度使用荧光光谱仪f4500，激发波长选择420nm，接收430-800nm的荧光进行测试。
采用激光共聚焦显微镜(clsm)进行荧光成像。
以下实施例所涉及的原料规格和厂家如下：
dmf、ch2cl2、mgso4、石油醚、乙酸乙酯、thf、ch3oh、正己烷、氯仿、无水三氯化铁、甲醇、二甲基亚砜、丙酮、异丙醇、醋酸、pbs缓冲液均为分析纯，购自北京化工厂；
3-羟乙烷噻吩、nah、1,6-二溴己烷、三甲基胺、琼斯试剂、噻吩、1,4-二溴乙烷、pd(oac)2、特戊酸、无水叔戊醇、dae([1,2-二(2-甲基-5-对醛基苯基噻吩-3-基)]全氟环戊烯、cas号348639-12-3)均购自j&k。
实施例1
一种式(ⅰ1)/(ⅱ)配合形成的聚3-(2-(6-溴化三甲胺基己氧基)乙基)噻吩/1,2-二(5-对羧基苯基-2-甲基噻吩-3-基)全氟环戊烯钠荧光开关体系。
其制备方法包括如下步骤：
(1)聚3-(2-(6-溴化三甲胺基己氧基)乙基)噻吩(结构式如式(ⅰ1)所示)的合成。
3-羟乙烷噻吩(663μl,6mmol)在氮气保护下加入nah(206mg,6mmol)的dmf溶液中，搅拌30min后，室温下在溶液中边搅拌边加入1,6-二溴己烷(4.6ml,10mmol)。搅拌12h后，加水淬灭。得到的混合物用ch2cl2提取3次，有机相用盐水清洗，并用mgso4干燥。去除溶剂后，产物在硅胶柱中用体积比为40:1的石油醚和乙酸乙酯洗脱，制得3-(2-(6-溴己氧基)乙基)噻吩(540.0mg,31％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)7.37(m,1h),7.15-7.10(m,2h),3.76(t,2h),3.57(t,2h),3.53(t,2h),3.04(t,2h),1.99(m,2h),1.72(m,2h),1.61-1.45(m,4h)。
在3-(2-(6-溴己氧基)乙基)噻吩(291mg,1mmol)的thf(0.5ml)溶液中加入三甲基胺(3ml)，该混合物在40℃下搅拌12h。多余的三甲基胺和溶剂减压蒸馏除去，剩余的固体在1ml的ch3oh溶液中溶解，并加入10ml正己烷得到白色固体6-(2-(噻吩-3-基)乙氧基)己基三甲基溴化铵单体(310.0mg,89％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)7.27(m,1h),7.02-6.98(m,2h),3.65-3.56(m,4h),3.47(m,11h),2.91(t,2h,6.78),1.75(br,2h),1.58(br,2h),1.42(br,4h)。
在反应瓶中依次加入8ml氯仿和无水三氯化铁(65mg,0.4mmol)，通半小时n2，然后滴加化合物6-(2-(噻吩-3-基)乙氧基)己基三甲基溴化铵单体(35mg,0.1mmol)的10ml氯仿溶液，室温反应2天。向反应混合液中加入甲醇，抽滤，滤饼用甲醇洗涤，采用体积比为1:10的二甲基亚砜/水溶解得到的固体，利用截留分子量为3500da的透析袋透析；除去溶剂，干燥得到16mg黄色固体聚3-(2-(6-溴化三甲胺基己氧基)乙基)噻吩(即pt)。
产物表征：1hnmr(400mhz,dmso-d6,ppm):7.75-7.31(br),3.32(br),3.08-2.51(br),1.52-1.25(br)。
(2)1,2-二(5-对羧基苯基-2-甲基噻吩-3-基)全氟环戊烯钠(结构式如式(ⅱ)所示)的合成，按照下述合成路径合成。
在250ml圆底烧瓶中用100ml丙酮溶解1g的1,2-二(5-对醛基苯基-2-甲基噻吩-3-基)全氟环戊烯(即dae)(1.73mmol)，开启搅拌，将反应体系放在冰浴中20分钟。之后，逐滴加入琼斯试剂(2.5ml,8.67mmol)。加完后反应2分钟，移除冰浴，室温下反应5小时。反应完成后，向反应体系中缓慢加入异丙醇直至体系开始变成绿色且能保持半分钟。旋蒸除去溶剂，用甲醇充分洗涤固体，之后抽滤除去不溶的固体。再次旋蒸除去溶剂，过硅胶柱(所用洗脱剂中氯仿、甲醇和醋酸溶剂的体积比为30:1:1)，最终获得浅蓝色固体1,2-二(5-对羧基苯基-2-甲基噻吩-3-基)全氟环戊烯(即daeo)，产量0.7536g，产率71.3％。
产物表征：1hnmr(300mhz,meod)δ8.04(d,j＝8.4hz,4h),7.70(d,j＝8.4hz,4h),7.52(s,2h),2.04(s,6h)。
13cnmr(75mhz,meod)δ167.81,142.86,141.27,137.28,130.26,129.78,129.30,125.84,124.92,123.74,67.46,13.24。
ms(maldi-tof；m/z,[m+na]+):calcd,631.1；found,630.9.
由以上结果分析可知获得了预期的产物。
将7.3mg的daeo粉末与5.5ml浓度为0.01mol/l的naoh水溶液混合，超声30min使daeo全部溶解，之后补加4.5ml浓度为0.01mol/l的pbs使总体积为10ml，获得1,2-二(5-对羧基苯基-2-甲基噻吩-3-基)全氟环戊烯钠(即daeona)的pbs溶液。
(3)制备式(ⅰ1)/(ⅱ)配合形成的pt/daeona荧光开关体系：配制3.7mmol/l的pt水溶液，取10.4μl的pt水溶液与256μl的daeona水溶液(1.2mmol/l)混合，加入0.01mol/l的pbs使总体积补充到1.2ml得到静电复合物混合液。所得静电复合物混合液中pt浓度为32μmol/l，daeona浓度为256μmol/l。
实施例2
一种式(ⅰ2)/(ⅱ)配合形成的聚3-(4-溴化三甲胺基丁基)噻吩/1,2-二(5-对羧基苯基-2-甲基噻吩-3-基)全氟环戊烯钠荧光开关体系。
其制备方法包括如下步骤：
(1)聚3-(2-(6-溴化三甲胺基丁基))噻吩(结构式如式(ⅰ2)所示)的合成。
其与实施例1的区别在于：
将噻吩(208.0mg,2.5mmol)，pd(oac)2(28.0mg,0.125mmol)，1,4-二溴丁烷(10.0mmol)，碳酸钾(7.5mmol,3eq)，特戊酸(5.1mg,0.05mmol)加入3.0ml无水叔戊醇中，在充满氮气后加热至100℃搅拌反应24h。之后旋蒸除去溶剂，过硅胶柱以乙酸乙酯/己烷＝10:90(v:v)为洗脱剂纯化出3-(4-溴丁基)噻吩(248.0mg,45％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6,ppm):7.59(s,1h),6.74(t,2h),3.51(t,2h),2.62(t,2h),1.7(m,4h)。
在3-(4-溴丁基)噻吩(219mg,1mmol)的thf(0.5ml)溶液中加入三甲基胺(3ml)，该混合物在40℃下搅拌12h。多余的三甲基胺和溶剂减压蒸馏除去，剩余的固体在1ml的ch3oh溶液中溶解，并加入10ml正己烷得到白色固体3-(4-溴化三甲胺基丁基)噻吩单体(270mg,97％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6,ppm):7.59(s,1h),6.74(t,2h),3.30(m,11h),2.62(t,2h),1.7(m,4h)。
在反应瓶中依次加入8ml氯仿和无水三氯化铁(65mg,0.4mmol)，通半小时n2，然后滴加化合物3-(4-溴化三甲胺基丁基)噻吩(28mg,0.1mmol)的10ml氯仿溶液，室温反应2天。向反应混合液中加入甲醇，抽滤，滤饼用甲醇洗涤，采用体积比为1:10的二甲基亚砜/水溶解得到的固体，利用截留分子量为3500da的透析袋透析；除去溶剂，干燥得到10mg聚3-(4-溴化三甲胺基丁基)噻吩固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6,ppm):7.75-7.31(br),3.08-2.51(br),1.52-1.25(br)。
(2)1,2-二(5-对羧基苯基-2-甲基噻吩-3-基)全氟环戊烯钠以及pt/daeona荧光开关体系的制备方法均与实施例1相同，此处不再赘述。
实施例3
一种式(ⅰ3)/(ⅱ)配合形成的聚3-(2-(6-溴化三甲胺基乙氧基)乙基)噻吩/1,2-二(5-对羧基苯基-2-甲基噻吩-3-基)全氟环戊烯钠荧光开关体系。
其制备方法包括如下步骤：
(1)聚3-(2-(6-溴化三甲胺基乙氧基)乙基)噻吩的制备。
其与实施例1的区别在于：
3-羟乙烷噻吩(663μl,6mmol)在氮气保护下加入nah(206mg,6mmol)的dmf溶液中，搅拌30min后，室温下在溶液中边搅拌边加入1,2-二溴乙烷(1.5ml,10mmol)。搅拌12h后，加水淬灭。得到的混合物用ch2cl2提取3次，有机相用盐水清洗，并用mgso4干燥。去除溶剂后，产物在硅胶柱中用体积比为40:1的石油醚和乙酸乙酯洗脱，制得3-(2-(2-溴乙氧基)乙基)噻吩(539.0mg,38.2％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6,ppm):7.61(s,1h),6.74(t,2h),3.87(m,4h),3.54(t,2h),2.75(t,2h)。
在3-(2-(2-溴乙氧基)乙基)噻吩(235.0mg,1mmol)的thf(0.5ml)溶液中加入三甲基胺(3ml)，该混合物在40℃下搅拌12h。多余的三甲基胺和溶剂减压蒸馏除去，剩余的固体在1ml的ch3oh溶液中溶解，并加入10ml正己烷得到白色固体3-(2-(2-溴化三甲胺基乙氧基)乙基)噻吩单体(280.0mg,95.2％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6,ppm):7.61(s,1h),6.74(t,2h),3.87(m,4h),3.54(t,2h),3.30(s,9h),2.75(t,2h)。
在反应瓶中依次加入8ml氯仿和无水三氯化铁(65mg,0.4mmol)，通半小时n2，然后滴加化合物3-(2-(2-溴化三甲胺基乙氧基)乙基)噻吩(21mg,0.1mmol)的10ml氯仿溶液，室温反应2天。向反应混合液中加入甲醇，抽滤，滤饼用甲醇洗涤，采用体积比为1:10的二甲基亚砜/水溶解得到的固体，利用截留分子量为3500da的透析袋透析；除去溶剂，干燥得到9mg黄色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6,ppm):7.75-7.31(br),3.32(br),3.08-2.51(br),1.52-1.25(br)。
(2)1,2-二(5-对羧基苯基-2-甲基噻吩-3-基)全氟环戊烯钠的制备方法均与实施例1相同，此处不再赘述。
(3)制备式(ⅰ3)/(ⅱ)配合形成的pt/daeona荧光开关体系：配制4.2mmol/l的pt水溶液，取10.4μl的pt水溶液与256μl的daeona水溶液(1.2mmol/l)混合，加入0.01mol/l的pbs使总体积补充到1.2ml得到静电复合物混合液。所得静电复合物混合液中pt浓度为36.4μmol/l，daeona浓度为256μmol/l。
实施例4
按照实施例1的方法合成一种式(ⅰ1)/(ⅱ)配合形成的聚3-(2-(6-溴化三甲胺基己氧基)乙基)噻吩/1,2-二(5-对羧基苯基-2-甲基噻吩-3-基)全氟环戊烯钠荧光开关体系，其区别在于：步骤(1)中，在反应瓶中依次加入8ml氯仿和无水三氯化铁(65mg,0.4mmol)，通半小时n2，然后滴加化合物6-(2-(噻吩-3-基)乙氧基)己基三甲基溴化铵单体(35mg,0.1mmol)的10ml氯仿溶液，室温反应1.5天。最终制得式(ⅰ1)的m为70。
实施例5
按照实施例1的方法合成一种式(ⅰ1)/(ⅱ)配合形成的聚3-(2-(6-溴化三甲胺基己氧基)乙基)噻吩/1,2-二(5-对羧基苯基-2-甲基噻吩-3-基)全氟环戊烯钠荧光开关体系，其区别在于：步骤(1)中，在反应瓶中依次加入8ml氯仿和无水三氯化铁(65mg,0.4mmol)，通半小时n2，然后滴加化合物6-(2-(噻吩-3-基)乙氧基)己基三甲基溴化铵单体(35mg,0.1mmol)的10ml氯仿溶液，室温反应2.5天。最终制得式(ⅰ1)的m为150。
对比例1：
按照实施例1的方法合成一种式(ⅰ1)/(ⅱ)配合形成的聚3-(2-(6-溴化三甲胺基己氧基)乙基)噻吩/1,2-二(5-对羧基苯基-2-甲基噻吩-3-基)全氟环戊烯钠荧光开关体系，其区别在于：步骤(1)中，在反应瓶中依次加入8ml氯仿和无水三氯化铁(65mg,0.4mmol)，通半小时n2，然后滴加化合物6-(2-(噻吩-3-基)乙氧基)己基三甲基溴化铵单体(35mg,0.1mmol)的10ml氯仿溶液，室温反应3天。最终制得式(ⅰ1)的m为200。
对比例2：
按照实施例1的方法合成一种式(ⅰ1)/(ⅱ)配合形成的聚3-(2-(6-溴化三甲胺基己氧基)乙基)噻吩/1,2-二(5-对羧基苯基-2-甲基噻吩-3-基)全氟环戊烯钠荧光开关体系，其区别在于：步骤(1)中，在反应瓶中依次加入8ml氯仿和无水三氯化铁(65mg,0.4mmol)，通半小时n2，然后滴加化合物6-(2-(噻吩-3-基)乙氧基)己基三甲基溴化铵单体(35mg,0.1mmol)的10ml氯仿溶液，室温反应1天。最终制得式(ⅰ1)的m为30。
对比例3：
按照实施例1的方法合成一种式(ⅰ1)/(ⅱ)配合形成的聚3-(2-(6-溴化三甲胺基己氧基)乙基)噻吩/1,2-二(5-对羧基苯基-2-甲基噻吩-3-基)全氟环戊烯钠荧光开关体系，其区别在于：所得静电复合物混合液中pt浓度为32μmol/l，daeona浓度为320μmol/l。
对比例4：
按照实施例1的方法合成一种式(ⅰ1)/(ⅱ)配合形成的聚3-(2-(6-溴化三甲胺基己氧基)乙基)噻吩/1,2-二(5-对羧基苯基-2-甲基噻吩-3-基)全氟环戊烯钠荧光开关体系，其区别在于：所得静电复合物混合液中pt浓度为32μmol/l，daeona浓度为128μmol/l。
测试例
(1)荧光开关体系中纳米粒子的粒径：用动态光散射仪测试对实施例1-5和对比例1-4制得的pt/daeona荧光开关体系中pt/daeona纳米粒子的粒径大小，实施例1制得的pt/daeona荧光开关体系中pt/daeona纳米粒子的粒径分布结果见图1。实施例1-5中纳米粒子的平均粒径主要分布在200-400nm之间。对比例1、3、4制得的pt/daeona纳米粒子的平均粒径均大于500nm，对比例2中因为pt溶解状态差平均粒径达到1μm。由此可知，采用实施例1-5的方法制得的pt/daeona纳米粒子平均粒径均在200-400nm之间，有较好的细胞穿透能力。
(2)荧光开关体系的荧光开关效果：分别取1ml实施例1-5和对比例1-4制得的pt/daeona荧光开关体系溶液放置在标准比色皿中，测试荧光强度。用强度为2mwcm-2的紫外光(313nm)照射30s后震荡摇匀测试荧光强度。再用强度为30mwcm-2的可见光(大于470nm)照射4min后震荡摇匀测试荧光强度。如此为一个循环，再重复测量四次这个循环，得到荧光谱和最大发射处的荧光变化图。其中实施例1中的荧光变化图如图2和图3所示，以上各实施例制得的荧光开关体系的荧光变化图表明该体系表现出了明显的荧光开关效果，且最大发射处的荧光开关效果变化足以满足细胞成像的需要。实施例1因其展现了较大程度的荧光开关效果而成为最优选择。对比例4的荧光变化图如图4和图5所示，其显示出较弱的荧光开关效果。各对比例制得的荧光开关体系的荧光开关效果也较差，不能满足细胞成像的需要。
(3)荧光开关体系的荧光量子产率：取2ml实施例1制得的pt/daeona荧光开关体系样品测试其荧光量子产率，测试结果为开环态of-pt/daeona的绝对荧光量子产率为2.34％，关环态cf-pt/daeona的荧光量子产率为0.99％。该结果表明pt/daeona体系关环态cf-daeona确实发生了对pt的荧光淬灭，但对于开环态的of-daeona并没有发生对pt的荧光淬灭。
应用例
以实施例1制得的pt/daeona荧光开关体系为染料对hela细胞和mcf-7细胞进行荧光开关成像。
在培养皿上培养hela和mcf-7细胞，待其贴壁后用4％的多聚甲醛固定细胞，再使用pt/daeona染细胞持续4小时。随后，用激光共聚焦显微镜(clsm)进行荧光成像。首先拍一张光照前的照片，再用clsm自带的紫外光照射细胞5s，拍照，再用clsm自带的激光559nm和633nm(简称559/633nm)一同照射细胞10s，拍照。hela细胞和mcf-7细胞的测试结果分别如图6和图8所示。
逐个点亮细胞的实验操作如下，先用clsm自带的紫外光照射细胞5s，拍照。之后选择单个细胞，用559/633nm照射10s，拍照，选择另一细胞，使用559/633nm照射10s，拍照，重复这个过程可以点亮更多细胞并拍照。hela细胞和mcf-7细胞的测试结果分别见图7和图9所示。
从图6和图8中可以看出，该纳米粒子均可用于hela细胞和mcf-7细胞的荧光开关；从图7和图9可以看出，该纳米粒子在hela细胞和mcf-7细胞中都表现出了选择性点亮单个细胞的能力。
由以上分析可知，动态光散射实验证明了pt和daeona形成的荧光开关体系中静电复合物纳米粒子粒径集中在300nm附近，说明了该纳米粒子具有较好的细胞穿透能力。
荧光开关实验证明该纳米粒子在水中有较强的荧光开关能力，荧光开关比例在3以上，能够在生物材料上看出荧光的改变。
量子产率实验结果表明，关环状态的体系荧光量子产率明显低于开环状态的体系，也就证明了该纳米粒子中确实发生了从聚合物pt到关环状态的daeona的能量转移过程，并没有发生从聚合物pt到开环状态的daeona的能量转移过程。
细胞成像实验证明了该静电复合物纳米粒子在细胞成像和选择性标记指定细胞的功能，可应用于生物成像和选择性点亮细胞。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
技术特征：
1.一种荧光开关体系，其特征在于，包括聚噻吩衍生物阳离子和全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子通过静电复合形成的纳米粒子，聚噻吩衍生物阳离子的结构如式(ⅰ)所示，全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子的结构如式(ⅱ)所示；
式(ⅰ)的结构为：
式(ⅱ)的结构为：
式(ⅰ)中，r选自
2.根据权利要求1所述的荧光开关体系，其中，式(ⅰ)中，r选自
3.根据权利要求1或2所述的荧光开关体系，其中，式(ⅰ)中，m为70-150。
4.根据权利要求1或2所述的荧光开关体系，其中，纳米粒子的平均粒径为200-400nm。
5.一种权利要求1-4任意一项所述的荧光开关体系的制备方法，其特征在于：将荧光产生单元和荧光调控单元在溶液中进行静电复合；所述荧光产生单元选自聚噻吩阳离子、聚噻吩阴离子、聚噻吩衍生物阴离子或者聚噻吩衍生物阳离子中的一种，所述荧光调控单元选自全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子或者全氟环戊烯型二芳基乙烯阳离子，所述荧光开关体系中荧光产生单元和荧光调控单元各自所带电荷的电性相反。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，荧光产生单元为聚噻吩衍生物阳离子、荧光调控单元为全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，聚噻吩衍生物阳离子和全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子的摩尔比为1:7-8。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其中，全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子按照如下方法制备：
(1)全氟环戊烯型二芳基乙烯醛在琼斯试剂作用下进行氧化处理制得全氟环戊烯型二芳基乙烯酸；
(2)全氟环戊烯型二芳基乙烯酸溶解于碱性溶液中制得全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子。
9.权利要求1-4任意一项所述的荧光开关体系在细胞成像中的应用。
10.权利要求1-4任意一项所述的荧光开关体系在hela细胞和mcf-7细胞成像中的应用。
技术总结
本发明涉及细胞成像研究所用荧光开关体系领域，公开了一种聚噻吩衍生物阳离子/全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子的荧光开关体系、制备方法及应用。聚噻吩衍生物阳离子和全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子在溶液中经过搅拌静电复合形成聚噻吩衍生物阳离子/全氟环戊烯型二芳基乙烯阴离子荧光开关体系，该荧光开关体系可用于HeLa细胞和MCF‑7细胞成像，所述荧光开关体系在紫外光存在下荧光减少，所述荧光开关体系在可见光存在下荧光恢复，实现荧光开关。
技术研发人员：王树;彭可;吕凤婷;刘礼兵
受保护的技术使用者：中国科学院化学研究所
技术研发日：.08.22
技术公布日：.12.20
