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杨树根系-真菌互作体系构建方法
Method for constructing poplar-root fungus interaction system
何兴华1, 2 #，单晓亮1, 2 #，彭龙1, 2，袁志林1, 2, *
1林木遗传育种国家重点实验室，中国林业科学研究院，北京；2中国林业科学研究院亚热带林业研究所，杭州
*通讯作者邮箱: yuanzl@
#共同第一作者/同等贡献
摘要:杨树 (Populus) 是重要的造林树种，也是研究林木基础生物学性状的模式材料。此外杨树可与多种真菌 (外生菌根真菌、丛枝菌根真菌和内生真菌)类群建立共生关系。目前，在杨树-真菌互作体系中，通过构建杨树-双色蜡蘑 (Laccaria bicolor) 和卷缘桩菇 (Paxillus involutus) 互惠共生提高杨树非生物胁迫能力的生理机制方面的研究已取得多项突破，而关于杨树-根系内生真菌互作的研究较少。我们构建了杨树-根系真菌悉生共生体系，为揭示树木和根系真菌之间互惠共生机制提供理想模型。该体系能够基于不同目的使用不同培养容器来研究真菌对树木的影响，这在现有的树木-外生菌根共生体系中很少见。构建杨树-真菌互作体系是研究一系列如共生真菌侵染结构观察、互作转录组研究等生物学问题的关键，并且有助于加深理解共生真菌对林木表型和生理代谢的表观遗传学调控机制。
关键词：杨树，真菌，互作体系
材料与试剂
1.琼脂 (北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，DING GOU，catalog number: DH010)
2.葡萄糖 (上海麦克林生化科技有限公司，麦克林，catalog number: D810588)
3.硫酸链霉素 (GENVIEW公司，GENVIEW，catalog number: AS325)
4.盐酸四环素 (上海麦克林生化科技有限公司，麦克林，catalog number: D807503)
5.NH4NO3 (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 6484522)
6.KNO3 (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10017218)
7.CaCl2·2H2O (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 20011160)
8.MgSO4·7H2O (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10013018)
9.KH2PO4 ( 国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10017618)
10.KI (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10017160)
11.H3BO3 (上海麦克林生化科技有限公司，麦克林，catalog number: B802544)
12.MnSO4·4H2O (上海沃凯化学试剂有限公司，沃凯，catalog number: B22081)
13.ZnSO4·7H2O (Sigma公司，Sigma，catalog number: Z0251)
14.NaMoO4·2H2O (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10019818)
15.CuSO4·5H2O (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10008218)
16.CoCl2·6H2O (Sigma公司，Sigma，catalog number: 31277)
17.FeSO4·7H2O (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10012116)
18.Na2EDTA·2H2O (Sigma公司，Sigma，catalog number: E6635)
19.IBA (Sigma公司，Sigma，catalog number: V9003250)
20.封口膜 (Polisciences Inc公司，Parafilm，catalog number: PM996)
21.PDA培养 (见溶液配方)
22.土豆汁 (见溶液配方)
23.IBA母液 (见溶液配方)
24.20×大量元素 (见溶液配方)
25.100×微量元素 (见溶液配方)
26.100×铁盐母液 (见溶液配方)
27.杨树-真菌共培养培养基 (见溶液配方)
28.改良MS生根培养基 (见溶液配方)
仪器设备
1.培养箱 (上海博讯，产品型号：SPX-250B-Z)
2.光照培养箱 (宁波扬辉，产品型号：RDN-1500B)
3.立式压力蒸汽灭菌器 (上海申安，产品型号：LDZF-50KB-II)
4.PC材料广口组培瓶 (带瓶盖，体积480 ml)
5.一次性塑料培养皿 (直径90 mm)
实验步骤
一、真菌材料的准备
1.菌饼接种剂准备
1.1PDA培养基灭菌后取出，室温下放置，待培养基温度约45 °C后，倒入15 ml PDA培养基至一次性塑料培养皿中，待培养基凝固后（约1 h后），进行接种处理。
1.2使用接种针从纯培养真菌菌落边缘挑取菌块，接种至PDA固体培养基表面，置于培养箱26 °C黑暗条件下培养。
1.3待培养7 d后，自菌落边缘使用打孔器 (直径7 mm) 取菌饼作接种剂。
二、杨树幼苗无性系组培扩繁
1.杨树无性系组培苗生根培养和继代繁殖
采用组培快繁的方法在短期内获得优质杨树无菌幼苗。以美洲黑杨杂种优良无性系NL895杨 (Populus deltoides×P. euramericana cv. ‘Nanlin895’，NL895) 和毛白杨 (P. tomentosa) 为例。
1.1超净工作台紫外消毒后，将杨树组培苗幼茎 (带叶片)剪断，高度约为2 cm，转接至改良MS (秦媛，) 生根培养基 (配方见表1)中，使组培苗直立，并尽量避免叶片碰到培养基，每个组培瓶扦插3-4株幼茎，盖上组培瓶盖。转移到组培室中，保持温度25 °C，湿度60 %，设置光周期12 h (光照强度为20, 000 Lx)。
1.2幼苗生根培养3周左右，苗高达到5-6 cm后，将组培苗取出进行继代繁殖。操作步骤同上。然后选取根系大小、发达程度和株高 (5-6 cm)较一致的无菌幼苗，进行共培养接种实验。
三、杨树无菌幼苗-根系真菌互作体系构建
1.大培养皿共培养体系
1.1超净工作台紫外消毒后，无菌大培养皿 (直径150 mm)中倒入100 ml杨树-真菌共培养培养基，使培养基在大培养皿中凝固后呈斜面 (如图1所示)。
1.2将挑选的根系和株高较为均一的杨树无菌幼苗用镊子轻轻取出，用无菌水小心洗除幼苗根部的琼脂，转接至大培养皿共培养基表面，每皿3株幼苗。使无菌苗根系贴附于共培养培养基表面，地上部分放置于不含共培养基的一侧 (如图1所示)，用封口膜进行密封，防止污染。然后转移至光照培养箱中，25 °C，设置光周期12 h (光照强度为20, 000 Lx)，培养7 d。
1.3待培养7 d后，将步骤一中获得的菌饼接种剂，随机挑取5个均匀转接至根系周围 (菌饼距皿壁约1.5 cm，如图1所示)，对照组接种无菌PDA琼脂块，用封口膜进行密封，防止污染。再次转移至光照培养箱中，25 °C，设置光周期12 h (光照强度为20, 000Lx)，继续培养。根据自身实验要求设计共培养时间，然后取样进行生理指标的测定。
2.大试管共培养体系
超净工作台紫外消毒后，无菌玻璃大试管 (直径25 mm，长度240 mm，瓶口带透气硅胶塞)中倒入60 ml杨树-真菌共培养培养基，待培养基凝固后待用。将步骤二挑选的根系和株高较为均一的杨树无菌幼苗用镊子轻轻取出，放入装有无菌水的玻璃大培养皿中，小心洗除根部的琼脂，并用无菌滤纸吸干表面水份后，转接至大试管共培养培养基表面，并使无菌苗根系贴附于共培养培养基表面 (如图2所示)。大试管瓶口用透气硅胶塞封口，并在透气硅胶塞上盖一层锡箔纸，再用塑料保鲜膜进行密封，防止污染。而后，转移至光照培养箱中，25 °C，设置光周期12 h (光照强度为20,000 Lx)，培养7 d。待培养7 d后，接种真菌菌株，每株无菌幼苗仅接种1个菌饼。
注：大培养皿体系主要目的是用于直观的观测根系内生菌对树木根系的促生作用，而大试管体系的目的是使根系内生菌完全侵染根系后可用于盆栽试验 (耐盐、耐旱等)。
图1. 大培养皿杨树 (NL895杨)-真菌共培养体系
该图为共培养21天后的NL895杨生长状态。Control：空白对照组；XDPOP-RS-16W和XDPOP-RS-16B为根际壳多孢霉 (Stagonosporopsis rhizophilae) 处理组，该菌株能够显著促进NL895杨根系的生长发育。
图2. 大试管杨树 (毛白杨)-真菌共培养体系
该图为共培养7天后的毛白杨生长状态。Control：空白对照；QYL-10为荷伯生氏斜盖伞 (Clitopilus hobsonii) 处理组，该菌株可以显著提高毛白杨的钾离子吸收。
溶液配方
1.PDA培养基
马铃薯 200 g (去皮煮熟后过滤取汁液)
葡萄糖 20 g
琼脂 15 g
加超纯水定容至1 L，用0.1 M NaOH溶液调pH至7.0，115 °C高温高压灭菌20 min。
2.土豆汁配制
马铃薯 200 g (去皮煮熟后过滤取汁液)
加超纯水定容至1 L。
3.0.5 mg/ml IBA母液配制 (w/v)
IBA粉末 0.025 g
先溶解于1 ml 95 %酒精中，再定容至50 ml，4 °C避光保存。
注：若有沉淀，65 °C水浴加热后使用。
4.20×大量元素 (w/v)
NH4NO3 33 g
KNO3 38 g
CaCl2·2H2O 8.8 g
MgSO4·7H2O 7.4 g
KH2PO4 3.4 g
加超纯水定容至1 L，4 °C保存备用。
5.100×微量元素 (w/v)
KI 0.083 g
H3BO3 0.62 g
MnSO4·4H2O 1.69 g
ZnSO4·7H2O 0.86 g
NaMoO4·2H2O 0.025 g
CuSO4·5H2O 0.0025 g
CoCl2·6H2O 0.0025 g
加超纯水定容至1 L，4 °C保存备用。
6.100×铁盐母液（w/v）
FeSO4·7H2O 2.78 g
Na2EDTA·2H2O 3.73 g
加超纯水定容至1 L，4 °C保存备用
7.杨树-真菌共培养培养基
土豆汁 100 ml
蔗糖 1 g
葡萄糖 1 g
NH4NO3 0.33 g
KNO3 0.38 g
KH2PO4 0.272 g
CaCl2·2H2O 0.088 g
MgSO4·7H2O 0.074 g
100×微量元素 2 ml
100×铁盐溶液 2 ml
VB1 0.01×10-2 g
琼脂 10 g
超纯水定容至1 L，用0.1 M NaOH溶液调pH 5.8，115 °C高温高压灭菌20 min。
待培养基常温冷却至45 °C左右，加入终浓度分别为0.02 g/L和0.008 g/L的硫酸链霉素和盐酸四环素，抑制细菌污染。趁热分装至大试管或大培养皿中，分装至大培养皿时，将大培养皿倾斜约20°待培养基凝固，使培养基在大培养皿中形成斜面。
8.改良MS生根培养基
20×大量元素 25 ml
100×微量元素 10 ml
100×铁盐母液 10 ml
蔗糖 20 g
琼脂 10.1 g
加超纯水定容至1 L，用0.1 M NaOH溶液调pH 5.8，对应加入300 μl (NL895杨)或100 μl (毛白杨) 0.5 mg/ml IBA，121 °C高压灭菌30 min。
注：大培养皿体系与大试管体系的共培养培养基均高压灭菌后，待培养基常温冷却至45 °C左右，加入抗生素，而后分装至容器中。
致谢
本工作的顺利开展得益于国家自然科学基金项目 (资助号：3172)和中央非营利性研究基础研究基金 (资助号：CAFYBBZY002-1和CAFYBBZA001-3)的经费支持，实验方案改编自中国林科院秦媛硕士发表的论文。
参考文献
1.袁志林, 潘雪玉, 靳微. (). 林木共生菌系统及其作用机制——以杨树为例. 生态学报, 39(01), 385-401.
2.秦媛. (). 盐碱地植物共生微生物资源及功能初步研究. 中国林业科学研究院
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