作者：白眉大侠
结直肠癌（CRC）是全球最高发肿瘤之一，目前手术仍然是CRC的主要治疗手段，但是化疗药物和靶向药物的出现，为CRC患者提供了更多的治疗手段和生存受益。已经上市用于结直肠癌治疗的靶向药物有：（1）VEGF：贝伐珠单抗、阿帕西普；（2）VEGFR：雷莫芦单抗、瑞戈非尼、呋喹替尼；（3）EGFR：西妥昔单抗、帕尼单抗；（4）PD-1/PD-L1：Pembrolizumab、Nivolumab；（5）CTLA-4：Ipilimumab；（6）BRAF：维莫非尼。
随着研究的深入，发现CRC是由一系列的基因突变诱发的分子异构疾病，常见突变基因有：KRAS、BRAF、PIK3CA、TP53、APC、CTNNB1、SMAD4、TGFBR2、SOX9、ERBB2等，引起Wnt/β-catenin、RAS-RAF-MEK-ERK（MAPK）、TGFβ以及PI3K-AKT等信号通路异常从而导致癌症进展。由于CRC疾病的复杂，现有药物治疗仍然存在不小的局限性；例如抗EGFR对于存在KRAS突变的CRC患者无效；PD-1药物被批准用于针对MSI-H/dMMR的CRC患者治疗，而对MSS的CRC无效，MSS在CRC中占大部分，尤其在晚期CRC占比为95%。
近些年在CRC治疗药物研发上取得了一定的进展。在一项日本进行的临床试验，VEGFR抑制剂瑞戈非尼联合PD-1单抗Nivolumab在MSS型mCRC中的治疗价值，瑞戈非尼采用剂量递增模式，耐受剂量为80~120 mg，24例MSS型mCRC患者临床试验结果显示，一共有8例（33%）取得客观缓解，而且8例患者全为男性、均有肺转移，多数（>70%）合并淋巴结转移，有1例同时合并肝转移。Array公司（被辉瑞收购）研发的BRAF抑制剂（Encorafenib）、MEK抑制剂（Binimetinib）和anti-EGFR抗体西妥昔单抗三联疗法用于治疗BRAF V600E突变的晚期CRC，公布的III临床试验结果来看，与对照组（化疗）相比在OS、PFS、ORR均有提升。
GUCY2C-CD3 双特异性抗体的CRC治疗效果不受KRAS和BRAF突变影响
年初辉瑞公司在Clinical Cancer Research发布题为《A Novel GUCY2C-CD3 T cell Engaging Bispecific construct (PF-07062119) for the Treatment of Gastrointestinal Cancers》的文章，介绍了他们研发的以GUCY2C和CD3为靶点的双特异性抗体PF-07062119；体外和体内动物试验数据表明，PF-07062119对GUCY2Y阳性的肿瘤组织具有良好特异性分布；在体外实验表明，PF-07062119具有强有力的T细胞介导的活性，在包括KRAS和BRAF突变肿瘤模型在内的多种人源肿瘤移植小鼠模型实验数据表明，PF-07062119具有良好的肿瘤抑制活性，与anti-PD-1/PD-L1或者VEGF抑制剂联用，可以进一步提高治疗效果。
PF-07062119是全人源的双特异性抗体，由两条分别靶向GUCY2C和CDε的scFv形成异源二聚体抗体与IgG1的Fc融合生成（如图 1），在Fc的CH2区域引入突变降低其与FcγR亲和力，使用KiH技术在Fc的CH3区引入突变，形成类似“杵臼”结构，有利于两条异源Fc的肽链正确装配，引入Fc结构可以增加PF-07062119的半衰期。
通过流式细胞实验显示，PF-07062119可以结合人T细胞和HCT116-hGUCY2C细胞，但不结合GUCY2C阴性的HCT116细胞。在一系列的结直肠癌细胞实验显示，PF-07062119显示纳摩尔级的T细胞介导的细胞毒性，呈现剂量和细胞表面GUCY2C表达密度的依赖性，IFNγ的分泌量也呈现剂量依赖性。GUCY2C信号通路可以调节肠道的稳态和流动性，体外实验数据显示，PF-07062119不会抑制GUCY2C信号通路活性。
辉瑞团队采用四种CLX（cell line xenograft）NGS小鼠模式和一种结直肠癌PDX（patient derived xenograft）NGS小鼠模型（如表 1），细胞表面的GUCY2C的表达水平不同，涵盖了KRAS和BRAF的突变类型。体内的实验室数据显示，PF-07062119对GUCY2C高表达量的小鼠模型中，在0.1~0.15mg/kg就显示出完全的肿瘤抑制，GUCY2C低表达量在1.0mg/kg呈现中等的抑制效果，和体外实验一样也呈现了剂量和细胞表面GUCY2C表达密度的依赖性，肿瘤抑制疗效与KRAS和BRAF的突变无关，这个实验结果提升药物的开发价值。另外，在LS1034原位小鼠模型体内试验研究发现，PF-07062119可以有效靶向肿瘤组织，在0.3mg/kg剂量给药下，肿瘤组织完全衰退，大于0.1mg/kg剂量给药未发现肿瘤转移，在0.3mg/kg剂量下出现了肝脏转移和腹壁扩散现象，PF-07062119可以抑制CRC的转移和扩散。此外，团队在具有免疫能力的CT26小鼠模型（GUCY2Y阴性）和利用转基因小鼠CT26-mGUCY2C模型（表达mGUCY2C和人CD3）上评价了PF-07062119对CRC的疗效，实验数据显示在1mg/kg给药剂量以上肿瘤完全消退。PF-07062119在体内动物实验均未见小鼠体重减轻，说明PF-07062119具有良好的肿瘤靶向活性。
表 1 Characterization of Colorectal Cancer Xenograft Models Tested for In Vivo Efficacy
在LS1034皮下过继移植小鼠模型实验发现，PF-07062119对于诱导T细胞肿瘤浸润呈现剂量依赖，TILs可以形成向肿瘤细胞极化的免疫突触端粒酶B，显示更加有效的肿瘤细胞毒性；但是PF-07062119可以上调肿瘤细胞PD-L1表达量，可以TILs的活性。团队在LS1034小鼠模型上评价PF-07062119与anti-PD-1/anti-PD-L1联合用药发现，在各个给药剂量可以显著提高PF-07062119的活性。
anti-VEGF/VEGFR药物是目前用于治疗CRC几类首选药物之一，有研究表明该类药物可以提高T细胞在肿瘤中的浸润来改善对T细胞介导治疗的反应。团队在PDX-CRX-1121的小鼠模型上评价PF-07062119与anti-VEGF-A药物联用的效果，试验数据显示，两者联用可以显著提高T细胞的肿瘤浸润，相比PF-07062119单独用药联用可以更低剂量的情况使得肿瘤完全衰退。
在食蟹猴上进行了PF-07062119的给药剂量增加的毒理和药代动力学评价。在PF-07062119口服或者注射给药过程中出现的副作用包括呕吐、体温轻微升高、运动减少、弯腰驼背、食欲下降、脱水、体重下降7%、轻微腹泻，所有的实验组未出现严重的副作用且均能够耐受PF-07062119的治疗；PF-07062119可以提高食蟹猴活化的CD8+T细胞比例，同时外周血细胞因子（IFN-γ, IL-2, IL-10 和IL-6）的浓度，在每个实验组第一次给药后观察到的细胞因子诱导在第二次给药后被抑制，提示有启动效应，但是并未出现耐受性和性别差异。
上述体外和体内多个模型试验表明，PF-07062119可以选择性的靶向GUCY2C阳性的肿瘤组织，包括CRC和其他胃肠道肿瘤，单独给药显示有效的抗肿瘤活性，在KRAS或者BRAF突变的结直肠癌同样显示出良好的活性，动物实验的毒性和耐受性均在可控范围之内；另外，与anti-PD-1/PD-L1药物和anti-VEGF/VEGFR药物联用可以进一步增强PF-07062119的疗效；目前，PF-07062119还处于临床前研究阶段，PF-07062119或者联合用药是否真的有效有待临床试验进一步验证。
GUCY2C的结直肠癌肿瘤疫苗和CAR-T免疫细胞治疗
针对GUCY2C这个靶点开发治疗CRC治疗方案不仅仅只有辉瑞在做，美国的Sidney Kimmel癌症中心科研团队通过将GUCY2C分子与增强免疫反应的分子PADRE连接起来，并将其加载到腺病毒载体中，进而开发了专门针对结直肠癌的疫苗Ad5-GUCY2C-PADRE，在临床前研究已经Ad5-GUCY2C-PADRE可以激活CD8+T细胞产生免疫应答，预防结直肠癌转移，Ad5-GUCY2C-PADRE不会激活CD4+T细胞，所以避免了自身免疫问题。目前，Ad5-GUCY2C-PADRE已经完成了10例患者的早期CRC的I期研究，最后结果，40％的患者表现出特异性T细胞应答，所有应答均为CD8+T细胞；所有10位患者均完成了研究，没有大于1级的不良事件发生；目前正在进行100人的II期临床试验，涉及四种癌症，结直肠癌、胰腺癌、食管癌和胃癌。同样来自Sidney Kimmel癌症中心科研团队利用靶向hGUCY2C的scFv作为CAR的构成基础，开发了靶向人GUCY2C的鼠源CAR-T细胞，在同源小鼠模型试验发现，靶向hGUCY2C CAR-T细胞可以识别并杀伤外源表达GUCY2C的人类结直肠癌细胞，抑制结直肠癌的肺部转移，使移植了人类肿瘤的免疫缺陷小鼠长期存活。
小结
辉瑞团队研发的PF-07062119不管是单独给药还是与anti-PD-1/PD-L1药物或anti-VEGF/VEGFR药物联用均展示了良好抗结直肠癌活性，肿瘤抑制疗效不受KRAS和BRAF的突变影响，这点提升药物的开发价值；以GUCY2C为作用靶点的结直肠癌治疗方案涵盖了当下热门的肿瘤疫苗和CAR-T免疫细胞治疗，为包括结直肠癌在内的胃肠道恶性肿瘤带来了新的治疗方案。目前，GUCY2C肿瘤疫苗走得比较靠前，已经进入临床II期，双特异性抗体和CAR-T免疫细胞治疗仍然处于临床前研究阶段，能否成药仍然需要临床试验进一步的验证。
GUCY2C靶点简介
鸟苷酸环化酶C（guanylyl cyclase C, GUCY2C）是一种跨膜蛋白，属于受体鸟苷酸环化酶家族成员，特异性表达于肠上皮细胞，尤其是在从十二指肠到结肠远端的整个延髓-尾轴上均高表达。GUCY2C由胞外N末端受体结合区、独立的跨膜区、具有激酶同源调节功能的胞质区、催化区和羧基末端。内源性的鸟苷素和尿苷素以及外源性的大肠杆菌热稳定肠毒素（STa）可以激活GUCY2C，活化的GUCY2C可以将GTP转化为cGMP，增加胞内的cGMP浓度，可以激活下游cGMP依赖的蛋白激酶PKGs、磷酸二酯酶PDEs和环化核苷酸门控离子(CNG)通道，起到：（1）刺激氯离子分泌和抑制氯化钠吸收，调节肠道功能；（2）刺激碳酸氢根离子分泌和抑制氢离子排出，调节肠道pH，促进消化吸收；（3）调节钠离子动态平衡；（4）通过肠道分泌粘液和水；（5）可以抑制细胞增殖和DNA合成，并有助于维持链接蛋白浓度，从而保护肠道屏障的完整性。
GUCY2C在原发性结直肠癌细胞中稳定表达，在肠外正常组织和肠外肿瘤中不表达，而在转移性结直肠癌细胞中GUCY2C的表达为正常肠上皮细胞的2~10倍；另外，结直肠癌淋巴结和肝脏组织转移GUCY2C表达均为阳性。在结直肠癌中，编码GUCY2C的内源性配体鸟苷素和尿苷素的mRNA受到明显抑制，而GUCY2C在结直肠癌和正常肠粘膜中无明显差异，由于GUCY2C配体的缺失导致结直肠上皮细胞稳态失衡，肠道上皮细胞连接形成的肠道屏障被破坏，促进肠道肿瘤的发生。
参考文献：
1、A Novel GUCY2C-CD3 T cell Engaging Bispecific construct (PF-07062119) for the Treatment of Gastrointestinal Cancers：Clin Cancer Res Published OnlineFirst January 29, ；
2、Split tolerance permits safe Ad5-GUCY2CPADRE vaccine-induced T-cell responses in colon cancer patients；Journal for ImmunoTherapy of Cancer () 7:104;
3、GUCY2C-targeted cancer immunotherapy: past, present and future; Immunol Res () 51:161–169；
4、Human GUCY2C-targeted chimeric antigen receptor (CAR)-expressing T cells eliminate colorectal cancer metastases; Cancer Immunol Res Published Online First April 3, ;
5、GUCY2C at the intersection of obesity and cancer; Trends in Endocrinology and Metabolism April , Vol. 24, No. 4;
6、Guanylate cyclase-C as a therapeutic target in gastrointestinal disorders; Waldman SA, Camilleri M. Gut ;67:1543–1552. doi:10.1136/gutjnl--316029;
bioSeedin柏思荟是生物医药行业的交流互动和知识服务平台，以优质的知识分享和领先的用户体验，帮助更多的生物医药人自我优化与提升，旨在汇聚行业领袖与人才，共同播种中国生物医药创新梦想的胚芽，重塑中国企业创新思考和认知边界。
bioSeedin目前正在进行关于抗体药技术和细胞治疗技术的相关分享，配合workshop、webinar、lab、conference等多种活动形式，满足企业不同所需。
bioSeedin Workshop以“融全球智力，为中国新药”为目标，着意于对创新型生物药研发人员的培养，致力于突破国内抗体药的转折点，向全球化、国际化迈进。
