无细胞合成生物学
前沿进展
生命科学与医学
领域概述系列
正文
无细胞合成——获取细胞中转录和翻译所需的基本组分，在体外添加DNA模板以维持基因转录、蛋白质翻译或代谢过程运转，从而合成目标产品。无细胞合成生物学（cell-free syntheticbiology—CFSE）去除细胞膜，可直接调控细胞内部生命活动；去除天然基因组，消除非必需基因调控，将细胞生长和核心代谢调控解耦；系统开放，无物质运输障碍，易于添加底物、去除产物并对过程进行监测分析，具有工程化最大的自由度，在基础学科及工程应用中均发挥重要作用：揭示了蛋白质翻译机制等生命体系；在结构生物学、高通量筛选、生物催化、生物医药等领域均有广泛应用潜力。本文将展示部分无细胞合成领域前沿工作。
图1. 无细胞合成生物学的优势及现有研究热点
UC Davis Cheemeng Tan 课题组发表在nature communication上的文章Holistic engineering of cell-free systems through proteome-reprogramming synthetic circuits[1]，该项工作利用细胞代谢网络间串扰，运用holistic synthetic biology概念（用module重整宿主生理代谢），应用表达translation machinery的local modules重编程细菌蛋白组，改变700余种蛋白质表达水平；优化buffer和细胞裂解液成分，最终，构建出表达水平5倍高于传统无细胞体系，可合成荧光蛋白deGFP、蛋白质纳米笼AfFtn（自组装成纳米笼的古细菌Archaeoglobusfulgidus储铁蛋白ferritin）及Cas9的无细胞体系。具有细胞毒性及挥发性的小分子苯乙烯生物合成工作在化石资源紧缺、环境恶化的当下尤为重要。西北大学Ashty S.Karim课题组发表于Metabolic Engineering的工作——高滴度苯乙烯无细胞生物合成Cell-free styrene biosynthesis at high titers[2]，该工作建立了苯乙烯大肠杆菌无细胞合成体系，L-苯丙氨酸经无细胞合成酶苯丙氨酸解氨酶phenylalanine ammonia lyase (PAL2) 和阿魏酸脱羧酶ferulic acid decarboxylase (FDC1)催化，以NH3和 CO2为副产物生成苯乙烯。在优化反应时间、温度、pH、酶浓度等参数后，将苯乙烯无细胞合成滴度从5.36 ± 0.63 mM提升至40.33 ± 1.03 mM（4.2 ± 0.1 g/L苯乙烯），这是目前不进行生产工艺优化及产物去除策略的生物合成最高产率。传统重组蛋白生产要经过片段扩增、克隆、测序、转染到表达宿主、细胞培养、菌落筛选、蛋白纯化等长耗时劳动密集型工作。Thermo Fisher Scientific 发表在ACS Synthetic Biology上的文章From Electronic Sequence to Purified Protein Using Automated Gene Synthesis and In Vitro Transcription / Translation[3]，该项工作开发始于蛋白序列、快速高通量自动化的无细胞蛋白生产流程PRESTO (Protein Expression Starting from Oligonucleotides)：将短核苷酸组装成线性DNA表达盒linear expression cassettes-LECs）和哺乳动物体外转录/翻译in vitro transcription / translation (IVTT)有效结合，通过设计算法优化蛋白质编码区、优化LECs（根据裂解液表达体系密码子偏好性、特定基序对转录翻译的不利因素、GC含量作出优化），尝试了17h-96种蛋白并行表达（在编码序列＜1.2kb前提下），加快合成生物学design-build-test 周期，并验证了该体系在生产活性酶及检验蛋白质相互作用的可行性。
图2.PRESTOLECs组装过程及其结构
综上，面对合成生物学难以标准化、不可预见性、不相容性及高复杂度的挑战，无细胞合成生物学手段展现其优秀特质，能够只专注于目标代谢网络/目标产物合成路线，元件相容性更高且更易实行标准化操作，结合工程化技术提供最大化合成效率及效益。期待未来涌现更多无细胞合成生物学方向的优秀工作。
参考文献（向上滑动阅览）
[1] Contreras-Llano, L.E., Meyer, C., Liu, Y. et al. Holistic engineering of cell-free systems through proteome - reprogramming synthetic circuits. Nat Commun11,3138 (). /10.1038/s41467-020-16900-7
[2]Grubbe, W.S., Rasor, B.J., Krüger, A., Jewett,M.C., Karim, A.S., Cellfree styrene biosynthesis at high titers, Metabolic Engineering ()
/10.1016/ j.ymben..05.009
[3]Chiocchini Claudia,Vattem Krishna,Liss Michael, Ludewig Lisa, Reusch Tobias, Rastogi Ischwaku, Webb Brian, Trefzer Axel. From Electronic Sequence to Purified Protein Using Automated Gene Synthesis andIn Vitro Transcription / Translation.[J]. ACS synthetic biology,.
DOI: 10.1021/acssynbio.0c00060
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