维生素D，学名胆钙化醇（Cholecalciferol），人们通常对它的认知就是提高人体对钙和磷的吸收，促进生长和骨骼钙化。如今，以中国科学家为首的研究团队首次揭示了VD3的另一个新功能，它可以帮助杀死胃上皮细胞内潜伏的幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori，后简称HP），该研究成果于发表在Autophagy（IF=11.06）杂志，题为《Vitamin D3 activates the autolysosomal degradation function against Helicobater pylori through the PDIA3 receptor in gastric epithelial cells》。
该研究团队通过HP小鼠体内感染以及体外细胞侵染实验揭示了VD3可以促进胃上皮细胞清除HP这一现象，并围绕这一现象展开了全面细致的机制研究，首次揭示了人胃上皮细胞自噬现象和幽门螺旋杆菌之间的“对抗”关系，发现VD3促进HP的清除机制在于它可以通过激活PDIA3-MCOLN调控途径的钙离子转运通路，从而使得自噬溶酶体的钙离子外排而使其内pH下降，自噬溶酶体酸化恢复正常。VD3的这一招“瓮中捉鳖”，使得潜伏在胃上皮细胞内的HP无计可施（包括多重耐药HP），在自噬溶酶体内迅速的被瓦解清除。
背 景
细胞自噬和细菌侵染有什么关系？
细胞自噬（autophagy）从发现至今已经被研究了50多年， 曾荣登诺贝尔奖台两次，其相关研究一直被视作得诺奖的热门而屡屡出现在各类诺奖预测名单中。自噬是细胞或者机体在缺乏能量、或受到胁迫环境，例如缺乏氨基酸、缺氧的情况下，就会在细胞里产生双层膜结构，可以包裹自己的一部分细胞质，运送到溶酶体进行降解。自噬是一种细胞生理现象，它的作用首先是自我保护，抗衰老、对抗损伤，也是人体天然免疫系统防御病原体入侵的重要组成部分。如下示意图所示，很多胞内寄生的胞内菌进入细胞是靠吞噬的作用，而后存在于液泡中（或者叫吞噬体phagosome），某些细菌（立克次体、志贺菌、李斯特菌）可以突破这个液泡逃逸到细胞质中（图左侧蓝色区域），而一些细菌（结核分枝杆菌、沙门氏菌）被吞噬体包裹（图右侧橙色区域），而这两类细菌的存在最终都会想细胞释放“eat-me”的信号，然后召集一系列的自噬相关蛋白来激活细胞自噬系统（autophagy induction），从而把要“吃掉的货物”隔离到自噬体（autophagosomes）中并限制其增殖，随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autolysosome），将病原体彻底清除。
当然，细菌选择通过进化来对抗宿主细胞的自噬作用，从而演化出各种各样的抵抗宿主细胞自噬的策略，也是如今细菌致病机制的研究热点。，Raju团队首次发现了幽门螺旋杆菌VacA蛋白参与了细胞自噬的过程，证明VacA可以阻止自噬体与溶酶体的融合，从而促进HP的胃部感染而引起后续的炎症和癌症的发生。随后越来越多的自噬相关基因也被发现在HP感染的过程中发生了表达的变化，但HP到底如何抵抗细胞自噬防御过程，细胞免疫和HP感染之间的到底是如何博弈的还尚未完全了解。
PART 1维生素D3可以在体内和体外清除HP感染
此文章为了验证维生素D3在对抗HP的作用，研究人员构建了幽门螺旋杆菌小鼠感染模型，将具有活性的维生素D3（1α, 25-dihydroxyvitamin）每隔一天灌胃给药，持续2个月后，通过16S基因定量分析、细菌荧光染色计数以及活菌菌落计数方法，发现小鼠胃内定植的HP （H. pylori SS1 strain）数量有明显的下降。为了进一步检测VD3对于胞内HP的杀伤能力，他们检测了VD3对于侵染入胃正常上皮细胞（HFE145）内的杀菌能力，处理72小时后，发现与体内实验结果一致，说明活性VD3确实可以有效的降低HP胞内的感染率（Fig1）。
Fig1. H. pylori was eradicated by VD3 both in vivo and in vitro
PART2VD3的杀菌作用是通过加强溶酶体的降解
CAMP/LL-37 (cathelicidin antimicrobial peptide)对于自噬起着重要的调控作用，它可以被VD3激活。之前的研究证明，小鼠的CAMP/Cramp可以保护小鼠胃部不被HP定植并引起胃炎。因此，作者想探究CAMP的表达是否参与了VD3对人类巨噬细胞和胃上皮细胞的抗HP感染这个过程。该团队发现，VD3确实可以明显加强CAMP的转录水平并进一步增强人巨噬细胞内的杀菌活性，但却没有在人胃正常上皮细胞内（HFE145， GES-1）发现这一现象（Fig2）。此外，通过体内实验发现VD3也不会引起小鼠胃部组织CampmRNA的升高。所以为了进一步验证VD3确实不会影响CAMP的转录，他们通过siRNA或者shRNA敲低HFE145或THP-1细胞内Camp基因的表达，发现Camp基因的敲除并不会影响VD3的杀菌作用。所以，VD3的杀菌作用并不会引起人胃上皮细胞Camp的表达。
Fig 2. Anti-H. pylori activities of VD3 were not mediated by CAMP expression.
于是该团队把研究方向转向细胞自噬是否参与了VD3的杀菌过程。MAP1LC3B/ LC3B 和SQSTM1是很好的细胞自噬marker，其中LC3B-I变成其脂化形式的LC3B-II被认为是自噬体形成过程中很好的标记marker，而SQSTM1是自噬体降解的marker。自噬过程中，组织蛋白酶CTSD （cathepsin D）是溶酶体中主要的酶，负责降解寿命长的蛋白，而它从蛋白前体转化成具有生化活性的成熟酶蛋白的过程被认为是溶酶体成熟的标志。基于此，该研究团队发现在VD3的处理下，细胞自噬的两个重要的标记marker， LC3B-II和SQSTM1的蛋白水平下降，说明VD3的处理可以促进细胞自噬体的降解而不影响细胞自噬体的形成（Fig3a）。当HP感染细胞时，LC3B-II和SQSTM1的蛋白表达反而会累积增多，暗示着HP的感染可以阻止自噬溶酶体降解的过程（Fig3a）。而VD3处理HP侵染的细胞HFE145时，LC3B-II和SQSTM1的蛋白累积量会降低，说明VD3处理感染的细胞可以阻止自噬溶酶体降解被抑制。此外，HP感染细胞可以抑制组织蛋白酶CTSD的成熟，而VD3可逆转HP的抑制作用从而促进 CTSD成熟。因此，该实验结果首次揭示了HP感染细胞后可以破坏细胞自噬溶酶体的降解，而VD3的加入可以恢复这一过程促使自噬体体降解正常程序化。
为了更好确证VD3的促进自噬体体降解是通过加强自噬体autophagic flux这一过程，作者首先想排除HP感染细胞会抑制自噬体和溶酶体的融合过程的可能性。他们发现当感染HP的细胞中加入chloroquine (CQ, 溶酶体水解酶的抑制剂，自噬体-溶酶体融合抑制剂，溶酶体降解抑制剂)，VD3的添加与否并不会影响感染细胞中LAMP1(lysosomal associated membrane protein 1)和LC3B的表达和定位。而当HP感染细胞被bafilomycin A1（Baf A1, vacuolar-type H+ -ATPase选择性抑制剂，可以有效抑制溶酶体酸化过程）处理后，VD3的使用可以抑制HP感染细胞中LC3B-II和SQSTM1的累积（Fig3c），又一次验证了HP感染确实影响了自噬溶酶体的降解过程。更重要的是，加入了Baf A1后，LC3B-II和SQSTM1在VD3处理与否的HP感染细胞中表达量并没有区别，说明VD3促进自噬体降解这一过程是基于增强其自噬溶酶体的降解过程而不是抑制自噬小体的形成。
前面已经提到VD3可以促使HFE145 细胞中CTSD成熟，说明VD3对于溶酶体活性起着上调的作用，为了进一步确证，作者利用LysoTracker Red来追踪细胞内的酸性小泡，发现HP感染可以减少溶酶体对于LysoTracker Red的摄入，而VD3的处理却可以增加其摄入（Fig3d），从而表明VD3可增加溶酶体的活性。不仅如此，VD3也可以增强CTSD蛋白的活性（Fig3e，f）。此外，他们还检测了溶酶体中两个重要的蛋白ACP2 (acid phosphatase 2, lysosomal)和NAGLU/β-N-acetylglucosaminidase, 同样也发现VD3的处理可以使它们的表达在HP感染细胞中恢复正常（Fig3g，h）。最重要的是，当添加CQ后，VD3的杀菌作用消失了（Fig3i）。基于以上结果，可以明确VD3的抗菌作用是通过增强胃上皮细胞内溶酶体的降解作用来实现的。
Fig 3. Anti-H. pylori activities of VD3 were mediated through enhancement of lysosomal degradation.
PART3HP通过破坏胃上皮细胞内的自噬体而顺利在人胃部生存
该研究团队通过观察感染HP患者的胃部上皮细胞发现，有大量的自噬体形成marker（LC3B-II） 的分布（Fig4a），而有趣的是，HP刚好也在和LC3B-II蛋白的定位发生重合，说明HP很有可能被“扣押”在了自噬体的内部。通过TSM电镜观察HP感染患者的胃部切片也发现确实有“洋葱状”（自噬体）的结构内包含有完整的HP以及包含有降解物质的自噬溶酶体（Fig4b）。为了更进一步确定被吞进的HP可以存活在不具有降解活性的自噬体中，他们通过siRNA把ATG5（autophagy related 5）或者BECN1 (beclin 1)敲低，这两个蛋白是参与自噬体形成中的关键蛋白)（Fig4c），发现敲低蛋白后的细胞可以更有效的将HP清除掉（Fig4d）。而且，侵染72H细胞内的HP的数量要比侵染48H后的数量有明显的增多，说明HP确实可以在自噬体形成缺陷的细胞内缓慢增殖（Fig4d）。因此，该结果揭示了HP确实可以侵袭到人胃上皮细胞内，并且通过抑制细胞内自噬溶酶体的降解过程而帮助它顺利在胃部存活。
Fig4. Autophagosomes were taken by H. pylori as survival niches in human stomachsPART4VD3可增强依赖Ca2+的溶酶体酸化作用来加强溶酶体的降解
为了证明VD3增强胃上皮细胞内溶酶体的降解作用是通过加强其溶酶体的酸化过程，该研究团队发现胃上皮细胞被HP侵染后，其酸化程度与加入阳性对照Baf A1一样，明显受到了抑制，而加入VD3会使溶酶体酸化作用恢复与正常未感染细胞一样（Fig5a）。此外，他们利用GFP-mCherry-LC3双荧光报告融合蛋白来检测胃上皮细胞HFE145内的溶酶体酸化过程。当HP感染细胞或者用Baf A1处理细胞时，发现有黄色光点代表GFP在碱性的环境下发光（绿色GFP与红色mCherry发生融合），确证了HP感染细胞确实可以造成溶酶体酸化受到抑制（Fig5b），而当加入VD3后，大多数细胞的黄色光点消失而变成红色的光点，因为细胞环境趋于酸性而使GFP无法在酸性环境中发光，所以进一步说明VD3可以促使溶酶体酸化而推进自噬溶酶体的降解（Fig5b）。此外，通过检测溶酶体体内的PH值发现，HP感染后会使细胞内的的溶酶体PH值上升，而VD3处理后会使之下降（Fig5c）。为了证明溶酶体的酸化可以对细胞清除HP起着关键作用，作者用了比Baf A1抑制性更强的Concanamycin A (Con A)阻断肠腔内溶酶体的酸化过程，结果显示Con A确实可以明显的抵消VD3的促酸化作用而使HP存活率升高(Fig5d)，再次验证了溶酶体酸化作用对于VD3抗菌效果的重要性。
钙离子的稳态被认为对胞内囊泡酸化起着重要作用，囊泡酸化需要氢离子的摄入，而两个离子的摄入和外排对细胞维持电势稳态有着重要的作用。该研究团队发现，当用VD3处理HP感染的胃上皮细胞HFE145后会有大量的钙离子的释放（Fig5e），说明当HP感染细胞后会有大量的钙离子的累积在溶酶体中。而单独用VD3处理未感染的胃上皮细胞后，所释放的钙离子有所降低（Fig5e）。因此，这个实验证明了HP感染细胞可造成细胞内溶酶体内钙离子等囤积，从而抑制其酸化过程，而VD3可以促使囤积的钙离子再次释放而恢复细胞正常的溶酶体酸化过程。
接下来，就是看到底是哪一个钙离子通道参与溶酶体酸化过程。他们选择了MCOLNs (mucolipins)为研究对象, 它属于瞬时受体电位通道的一个亚族，被预测为溶酶体上钙离子转运通道。首先，他们关注该通道中一个膜蛋白TRPML3 (mucolipin 3)，通过WB发现HP感染细胞后可以使之表达量降低，而VD3会使该蛋白的表达量恢复正常（Fig5f）。此外，当把HP的cytotoxin-associated gene A (CagA)基因敲除后，再感染胃上皮细胞，发现CagA敲出株对TRPML3 (mucolipin 3)蛋白的表达抑制并没有野生株那么强了，这说明CagA很有可能也参与了HP感染后的MCOLNs的下调作用。而敲低MCOLNs之后，VD3没有办法有效的清除胃上皮细胞内HP的感染（Fig5g，h），不仅如此，溶酶体内的钙离子也在敲低MCOLNs的背景下开始累积（Fig5i）。以上结果很好的阐释了MCOLNs通道确实是胃上皮细胞内溶酶体钙离子运输的关键通道，而VD3可以帮助该通道加速外排钙离子，从而促进氢离子摄入而使溶酶体酸化顺利进行，加强溶酶体的降解，清除胞内HP。
Fig 5. VD3 enhanced lysosomal degradation function via Ca2+-dependent lysosomal acidification
PART5胃上皮细胞内的VD受体PDIA3对VD3的杀菌作用起着关键作用
那么是什么决定了钙离子通道的打开呢？当然，最开始想到的肯定是钙离子的受体，VDR（vitamin D receptor)，被认为对VD3的摄入起着决定性的作用。因此，该研究团队将细胞的VDR敲除，再用HP侵染后发现，HP对于细胞的侵染能力竟然并没有发生变化，说明VD3的抗HP作用和VDR并没有什么关系。接着，他们又关注另一个最新发现的非典型的VD受体，叫PDIA3，它被认为是应激反应蛋白，位于细胞的很多位置比如ER，细胞膜以及细胞核。意外的是，当他们抑制PDIA3的表达时，可以有效减弱VD3的杀菌作用(Fig6a，b),说明PDIA3确实对于VD3的杀菌能力起着至关重要的作用。而利用CRIPSR-Cas9彻底敲除PDIA3后，可以非常明显的降低VD3的杀菌能力，进一步验证了上述观点，说明了PDIA3在VD3杀HP的重要性。更有趣的是，该团队发现了PDIA3也可以调控MCOLNs的表达，当PDIA3在HFE145中被敲除后，MCOLN的表达降低（Fig 6e）， 溶酶体的钙离子的外排升高（Fig 6f），逐渐升高的溶酶体的PH值（Fig 6g）使得ACP2（Fig 6h）和NAGLU的活性降低（Fig 6i）。与此同时，成熟的CTSD表达降低，SQSTM1和LC3B-II的表达上升（Fig 6j）。总而言之，一旦PDIA3或者受其调控的MCOLN的表达受到抑制，便可以有效阻止自噬溶酶体的降解。而VD3之所以可以促进HP的杀菌作用，是因为它可以恢复人胃上皮细胞的自噬溶酶体的降解，通过依赖于PDIA3-MCOLN这一途径的钙离子转运通路（Fig 9）。
Fig 6. The PDIA3-MCOLN3 axis was necessary for the VD3-induced anti-H. pylori effect
Fig 9. Schematic diagram depicting the proposed mechanism by which VD3 exerts anti-H. pylori effects
PART6PDIA3-STAT3蛋白复合体的核转运可以调节MCOLN的表达
前面只知道PDIA3的表达与MCOLN的表达有正相关的作用，但是PDIA3具体如何调控MCOLN还未知。作者通过研究发现转录因子STAT3参与了VD3介导的MCOLN通道蛋白的表达，首次揭示了PDIA3可以与STAT3在HFE145细胞内直接结合（Fig 7a）。当VD3处理感染细胞时，PDIA3-STAT3蛋白复合体核内表达升高，向核内转运（Fig 7b）。通过ChIP-PCR，他们发现用VD3处理后的细胞，转录因子STAT3可以直接结合在MCOLN3的启动子区域（Fig 7c），而当彻底敲除STAT3基因后，VD3对MCOLN3基因的转录失去了作用（Fig 7d）。因此，该实验结果说明VD3可以将PDIA3-STAT3蛋白复合体“发配”到HFE145的细胞核内，然后结合在MCOLN3的启动子区域，上调MCOLN3蛋白的表达（Fig 9）。
Fig 7. Nuclear translocation of the PDIA3-STAT3 protein complex modulated MCOLN3 expression
PART7抗生素耐药的幽门螺旋杆菌也可以被VD3有效清除
当VD3的有效生理浓度达到200 pM或者200 nM时，可以有效清除HFE145细胞内的HP，胞内HP存活率分别为42%和28%（Fig8a-c)。对于两株临床分离的三重耐药临床菌株（克拉霉素，左氧氟沙星和四环素耐药），VD3依然具有同样明显的杀菌效果（200 pM) （Fig8d-i)。
Fig 8. Antibiotic-resistant H. pylori strains were efficiently cleared by 1,25D3 at a physiological concentration
结 语
HP是首次证明可以存活在胃部的微生物，但是它到底如何生存在这一个极酸的胃部环境，一直都是科学家关心的热点问题。这篇文章提供了很好的证据揭示HP确实可以在人胃上皮细胞内生存并且繁殖，尤其是在自噬溶酶体失活的上皮细胞内，而使人胃上皮细胞自噬溶酶体失活的罪魁祸首竟然就是“寄生”在其中的HP。该研究团队发现发现幽门进入胃上皮细胞后，可以隐匿在细胞的自噬小泡中并且抑制了自噬溶酶体的酸化。而维生素D3可以通过激活VD3受体PDIA3来恢复这样的抑制作用，该过程首先激活PDIA3受体，促进PADI3-STAT3蛋白复合体的核内转运，随后上调钙离子转运通路MCOLN3，导致溶酶体内Ca2+的外排，从而使自噬溶酶体泡酸化恢复正常。此研究首次揭示了HP在体内抗宿主免疫的一个新机制，通过小鼠体内感染和人胃上皮细胞体外侵染实验充分证明VD3确实对于胃上皮细胞清除HP起着至关重要的作用，虽然VD3对人胃内HP杀菌作用还未知，但是这个新发现很有可能为人类未来抗HP感染的药物中又添一员猛将！
维生素D3还可以杀幽门螺旋杆菌——科学家首次揭示维生素D3可以帮助胃上皮细胞清除幽门螺旋杆菌...
