论坛内经常会有站友提到ROS测不好，ROS测不好的原因有多方面的，在此，从Methods in Molecular Biology一书中摘录并翻译部分关键性技巧，与正在做ROS的你分享：
1、必须使用无血清培养基，因为血清含内源性酯酶活性，会使二氯荧光素（DCF）脱酯化，导致其渗透性较差并且会产生不一致的数据。
2、DCFDA进入细胞并主要积聚在胞质中。为了避免任何细胞毒性，细胞应该装载低浓度的DCFDA。对于各种细胞类型，我们发现在1～10mM下加载45分钟至1小时是足够的。更高水平的DCFDA或高光强度也可能导致人为光化学氧化为可能被误认为ROS生成的荧光产物。
3、由于易氧化，CM-H2DCFDA的工作溶液应该在实验之前新鲜配制。
4、建议实验时组别设置参考如下实验，设置一组不染色的，设置阴性Marker，然后以此Marker圈定阳性区域，读取该区域内的MFI变化。尽管大家看到比较常见的典型图形应该是全阳性才对，但实际和理想总是存在差异，或许仍有部分细胞DCFDA进不去，所以此时，读取阳性区域的MFI变化是可取的。
图1. 将纯化的Gr-1 +脾细胞与2mM DCFDA在37℃孵育15分钟，然后用PBS洗涤两次。
5、H2DCFDA尽管可进入细胞，但也容易随着时间漏出，所以如果检测时间较长，或希望监测ROS随时间变化的话，还是推荐采用改良版的CM-H2DCFDA。
参考文献： Evgeniy Eruslanov and Sergei Kusmartsev. Identification of ROS Using Oxidized DCFDA and Flow-Cytometry
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