这里给大家分享一篇PNAS上的文章，题目为“Exploiting correlated molecular-dynamics networks to counteract enzyme activity–stability trade-off”（DOI:10.1073/pnas.1812204115）。本文的通讯作者为伦敦大学学院的Paul A. Dalby教授，研究方向是寻找改善生物催化酶和治疗蛋白的稳定性和活性的途径，结合计算以及生物物理学来了解影响蛋白质稳定性的因素。酶作为天然催化剂在工业应用方面具有很大的潜力。然而，酶的天然底物特异性通常不能满足工业需求。定向进化已成为获得具有扩大底物范围的突变体的有效策略，然而，在提高活性或扩大底物特异性的定向进化过程中，通常带来酶蛋白稳定性的丧失。酶稳定性和活性之间的负相关性已被充分证明，即所谓的活性-稳定性权衡。大肠杆菌转酮酶（TK）是硫胺素二磷酸（ThDP）和Mg2+依赖性同型二聚体酶，其催化C2-酮醇单元从D-木酮糖-5-磷酸可逆转移至D-核糖-5-磷酸或D-赤藓糖-4-磷酸，将糖酵解与戊糖磷酸途径连接。为了增加合成新型二羟基酮化合物的潜在用途，大肠杆菌TK已通过一系列智能库方法进行工程改造，以将其底物范围从磷酸化的极性受体扩展到非磷酸化的极性受体，然后扩展到非极性脂肪族底物，再到异质-芳香族和非极性芳香族底物，当使用引导或半定向进化策略时，它使其成为研究稳定性和新功能之间关系的一个很好的模型。作者先使用分子动力学模拟研究了这种平衡的可能原因，结果发现3M（S385Y/D469T/R520Q）突变体中的活性位点周围的区域和突变位点附近的残基在高温下变得更加柔韧并导致稳定性和协同性的降低。由于活性位点残基不是定向进化良好目标，作者假设活性位点之外的区域可以恢复3M突变体中的稳定性丧失。其动力学与活性位点灵活性相关，将是稳定性突变的良好靶标。已知四种突变（H192P，A282P，I365L和G506A）可以提高TK稳定性，并且位于与3M中柔性活性位点相关的区域。于是作者构建并表征了六种3M变体，其中四种变体增加了热稳定性，并且仍然保持或改善了酶活。MD模拟初步讨论活性-稳定性平衡使用MD模拟来研究3M突变体结构在300K和370K下的柔性变化，在30 ns的模拟时间内，3M突变体的RMSD值高于野生型（图1A），并且在370K时二者RMSD差值更大，这表明3M突变体的构象灵活性增加，但这也将导致3M的稳定性下降。作者通过370K时的RMSF进一步分析3M的局部柔性（图1B），与WT相比，3M具有更高的灵活性（图1B中的红色区域），主要位于突变位点S385Y和D469T周围以及Gly104，Trp196和Glu646周围的五个区域，它们都位于TK两个单体之间的界面处（图1C）。该二聚体界面网络在蛋白质上以连续条带端对端连接。 WT和3M之间的结构对齐表明3M中的这些柔性区域在370K的模拟期间经历了显着的局部展开。然而，这种螺旋在3M中在20和30ns处丢失，但在WT中任然保留（图1C）。3M中二聚体界面处的这种柔韧增加和局部解折叠将削弱单体之间的相互作用并导致整个结构的不稳定。图1.（A）WT和3M的RMSD比较；（B）WT和3M的RMSF比较；（C）WT和3M的结构比较；（D）3M模拟后10ns的DCCM。设计3M以提高稳定性为了设计3M的稳定性，可以选择直接加固MD模拟中的柔性区域。然而这些区域也形成了3M突变体的活性位点，修改它们可能会导致与稳定性-活性平衡相反的活性的丧失。为了识别与3M中的柔性活动部位区域动态相关的区域，我们计算了3M的动态交叉相关图（DCCM），经历灵活性变化的区域（图1B）也显示出彼此良好的动态相关性（图1D）。例如，Tyr385周围的区域与Thr469周围的区域保持很强的正相关，而Thr469与C末端的Glu646周围的区域呈正相关（图1D）。另外，Tyr385和Thr469周围的区域也显示出与残基250-300上的片段中的动态的负（反）相关性，这解释了3M中区域T245-T257和W279-I290的稳定性。有趣的是，之前稳定野生型的一些突变位于与3M的高度灵活的活性位点/二聚体界面区域具有高度相关动力学的区域中。例如，突变H192P位于片段N185-H192中，其在3M中具有降低的柔性，并且与Tyr385周围的区域具有直接相互作用（图1C）。类似地，A282P位于250-300区域，与WT相比，其在3M中的灵活性显着降低，但是与Tyr385或Thr469周围区域中的那些相反的动力学参数。最后突变I365L和G506A位于与3M中的柔性活性位点区域具有正动态相关性的区域中。因此，作者将这些突变引入3M变体，以检查它们是否也通过相关动力学网络稳定3M突变体。加热后TK突变体活性作者构建了6种突变体，在高温下暂时加热后评估了它们的热稳定性，结果如图2A所示。当在60℃加热10分钟时，3M仅保留0.9％的活性，并且3M / H192P和3M / A282P保持与3M相似的活性水平。相比之下，5M / I365L显示出最高的残留活性，为32％，比在60℃加热后的3M高近35倍。另外两种突变体，5M / G506A和7M，在60℃加热后，与3M相比，残余活性分别提高了17和27.8倍。
图2（A）TK突变体残留活性；（B）在55℃时TK变异体活性损失的二阶动力学参数。突变体半衰期测定作者测定了活性残留最高的四种变体（5M，5M/I365L，5M/G506A和7M）在55℃下酶活性丧失的半衰期。3M变体在55℃时迅速失去活性，120分钟后仅保持初始活性的4.6％，而5M，5M / I365L，5M/G506A和7M的残留活性分别为19.8％，40.7％，31.4％和分别为34.8％。通过将变性数据拟合到二阶降解函数来计算降解速率常数kd（图2B）。所有四种新突变体的kd均低于3M，表明新突变体的失活速度更慢。 5M/I365L的半衰期最长，为102.5分钟，比3M变体的17倍提升了17倍。5M，5M/G506A和7M也明显高于3M。突变体热力学稳定性作者测定了新突变体的Tm和Tagg，3M/H192P，3M/A282P和5M的Tm值与3M相比基本不变，而5M/I365L，5M/G506A和7M的Tm比3M分别提高了1.5℃，1.3℃和2.9℃。有趣的是，7M的Tm甚至比WT高0.6℃，这表明在3M变体中失去的热稳定性重新获得。与Tm值一致，7M具有最高的Tagg值（64.1℃)比3M高4.3℃，比WT高1.2℃，表明对热诱导聚集的耐受性增加。突变体酶促反应动力学参数作者对新突变体对不同底物的酶促反应动力学参数的测定：
表1.TK突变体的比酶活。
表2.TK突变体的动力学参数。TK突变体的MD模拟分析3M和WT中的突变稳定了相同相关网络内的不同结构，为了解WT和3M的突变体中相对于它们各自初始结构动力学和稳定性的哪些结构特征是稳定的或不稳定的，作者研究了所有突变体在370K（图3B）的RMSF值并计算变体与其各自的ΔRMSF（图4C）。突变体的结构显示在图4D中。热图显示突变体在大多数结构中没有显着改变柔韧性（图4C中的白色区域）。相反，WT或3M中每个突变的影响增加（图4C中的红色）或减少（图4C中的蓝色）有限数量的局部结构区域（主要是D81-K96，G99-Y105，Q136-D143，N185-H192，G195-D200，T245-A282，D381-N386，D469（T）和V630-K660）的灵活性。除了D381-N386，变化只发生在3M及其突变体，其他区域在WT和3M变体都是常见的。3M和WT中的突变对相关网络内每个区域的灵活性产生不同的影响，例如，残基251和520周围的区域通过WT中的突变而刚性化，但在3M中却没有（图3C）。通过WT中的突变显着改变T245-T257环和包含两个表面螺旋加环的邻近区H258-A282的环的灵活性（图3D）。这些区域距离二聚体界面更远并且位于TK的PP结构域的表面上。两个突变体H192P和A282P位于该区域附近，并且这两个突变本身都不能稳定T245-T257环，使其部分比WT更灵活（图3C）。然而，这两个单突变的组合效应使T245-T257环变得僵化（图3D）。I365L或G506A的后续突变使H258-A282的灵活性增加至高于WT的灵活性，而突变体H192P/A282P/I365L/G506A再次使其刚性化（图3C和D）。
图3.WT突变体和3M突变体柔性比较。总体而言，在WT突变体中跨越T245-A282的表面区域的选择性稳定将延迟单体解折叠，相对于热升高期间的二聚体解离，这解释了WT突变体的Tm逐渐增加，但是它们在展开协同性中逐步降低。WT的突变体导致二聚体界面的灵活性受到混合影响，一些区域稳定（H94-G108，N185-H192，E642-G649）和其他区域不稳定（G195-D200）。因此，WT突变体中二聚体界面的变化不太可能对Tm的变化或展开的协同性有显着贡献。这与3M突变体本身形成对比，其中二聚体界面比WT更灵活。本文的研究意义在于：将柔性位点刚性化是提高酶稳定性的有效方法，但是如果高度灵活的区域形成活动位点，则修改它们可能会因活性-稳定性平衡而导致活力降低。作者假设在活性位点以外的区域，其动态变化与柔性活性位点高度相关，将为稳定性突变提供良好的目标。为了检验该假设，在大肠杆菌转酮酶的3M突变体中构建了六种突变体。结果最好的突变体在55°C时的半衰期提高了10.8倍，并且Tm和Tagg分别增加了3℃和4.3℃。这些突变体甚至将酶活提高了了三倍。
