吴重德，博士，副教授。主要从事食品微生物（乳酸菌、酵母菌）、传统发酵食品微生物生态学、食品安全、微生物生理学及系统生物学等方面的研究。近年来，以典型传统发酵食品为研究对象，通过多组学技术解析酿造食品微生物群落结构与功能、微生物间相互作用及代谢机制等，阐释群体微生物发酵机制，以期进一步提升和改造传统发酵工艺。
我国传统发酵食品如白酒、酱油、食醋、豆瓣酱、豆豉等风味独特，营养丰富，大多采用自然接种的开放式发酵生产，在发酵过程中，微生物将原料中的淀粉、脂肪、蛋白质等分解成小分子物质，并利用这些物质进行生长、繁殖和代谢。微生物与环境、微生物与微生物间均存在着某种联系且在发酵过程中发挥重要的作用。其中，微生物间的相互作用关系十分复杂，并对食品的风味品质有深刻影响。因此，深入剖析发酵过程中微生物群落结构及变化规律、阐明微生物间相互作用关系，有助于进一步揭示群落与功能的关系，解析发酵食品酿造机制以及风味形成机理，实现微生物定向调控，为提升生产效率和改善产品品质奠定基础。
1 传统发酵食品微生物群落结构
中国传统发酵食品大多采用非人工接种的自然发酵方式，其中的微生物大多源于自然界微生物、原料自身所携带的微生物，或经长期驯化的微生物群。发酵原料中丰富的营养物质和开放或半开放的发酵方式共同促成了发酵食品中微生物的多样性。发酵过程中，微生物间的相互作用及微生物与环境间的相互作用使体系内部形成了一个在时空上持续演变又相对稳定的生物群落结构。对群落结构的研究可以帮助我们从单一样本粗略推断体系的发酵情况，了解特定微生物的变化及其对发酵的贡献，预测下一步发酵的走向，对于定向控制发酵过程微生物种类、提高生产效率、改善传统发酵食品风味和保证食品安全提供保障。
然而，我国传统发酵食品中涉及的微生物多样性高、代谢产物复杂，对群落结构的分析提出了挑战。目前对群落结构的研究方法有传统纯培养技术、免培养技术和组学技术。传统纯培养技术是用培养基对微生物进行分离纯化，然后通过微生物的菌落形态和生理生化指标或测序鉴定确定菌株属种的技术。对于一些不易培养和不可培养的微生物，通常采用免培养技术进行研究，包括有FISH（fluorescence in situ hybridization）技术、PCR-DGGE（polymerase chain reaction-denaturing gradient gelelectrophoresis）技术、PCR-SSCP（polymerase chainreaction-single strand conformation polymorphism）技术、PLFAs（phospholipid fatty acids）技术、RFLP（restriction fragment length polymorphism）技术等。现代分子生物学技术的发展使得组学技术为研究发酵食品中微生物组成及物质产生的分子机制提供了技术支撑，大量未培养微生物得以被检出，进一步丰富了对群落结构的认识（表1）。如Yang等利用宏转录组学技术对豆豉发酵中微生物多样性及其动态变化规律进行了研究，并对所得到的181 443个细菌16S rRNA序列进行了分类，结果表明，发酵过程中存在20个细菌属，其中葡萄球菌属和魏斯氏菌属为优势属。发酵过程中，葡萄球菌属占总属比值从第1天的30.33%急剧下降到第3天的4.06%，在第9天迅速恢复到60.83%，但在第15天又急剧下降到9.75% ；魏斯氏菌属占总属比值从发酵第1～3天的34.05%小幅上升至48.79%，在第3 ～ 9天中下降到2.6%，但在第9天恢复到15%，然后继续下降，在发酵结束时成为一个少数属，这表明葡萄球菌属和魏斯氏菌属存在种间竞争，其中魏斯氏菌属可代谢分泌细菌素和酸，有利于成品风味，同时抑制细菌的生长。在后期发酵中，不动杆菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、乳杆菌属和假单胞菌属发挥着重要作用，其代谢产物分泌可能刺激了葡萄球菌属和魏斯氏菌属的生长。中国白酒发酵中微生物多样性及其演变一直是传统发酵食品研究的热点之一，已有文献采用传统纯培养技术对茅台酒大曲中分离得到的200多个菌落进行了表型和常规生化分类学方法鉴定，结果表明分离菌株包含细菌、霉菌和酵母菌。细菌有芽孢杆菌、醋酸杆菌、乳酸菌等，霉菌有曲霉、毛霉、根霉等，酵母菌有酿酒酵母、汉逊酵母、毕赤酵母等。基于PLFAs和PCR-DGGE方法对浓香型白酒发酵窖中微生物群落结构进行研究，结果表明窖泥和糟醅中总微生物量明显高于黄水，且与窖池年龄密切相关，真细菌有乳酸菌科、梭菌科、卟啉单胞菌科等，古细菌以甲烷菌、甲烷小孢子菌、甲烷还原菌等为主，真菌以毕赤酵母属为主。利用宏转录组学的方法揭示了浓香型白酒大曲微生物群落中具有重要功能的微生物和关键转录本，真菌被认为是最丰富且活跃的微生物，多种碳水化合物活性酶、一些潜在的耐热酶及糖酵解、淀粉、丙酮酸和乙醇代谢过程中关键酶被检测出且在不同发酵阶段表达量变化明显。这些研究技术的进步加深了对传统发酵食品中微生物多样性及其功能的了解，为进一步挖掘微生物菌群所蕴含的应用价值、解析群落相互作用关系及微生物的定向调控奠定了研究基础。
表1传统发酵食品微生物群落结构
2 传统发酵食品中微生物相互作用关系
2.1 微生物间相互作用关系
传统发酵食品生产中，不仅微生物同发酵过程中的环境有着密切联系，微生物间的生态学关系也十分复杂，微生物间的协同作用、拮抗作用等对发酵食品最终风味的形成和新物质的产生有着深刻影响。近年来，国内外学者对发酵食品中微生物间相互作用关系及互作机制进行了解析，所涉及的微生物主要包括乳制品中乳酸菌与乳酸菌或乳酸菌与酵母菌、肉制品中乳酸菌与李斯特菌等、白酒中细菌与酵母菌等。其中，关于乳酸菌与乳酸菌以及乳酸菌与酵母菌的相互作用关系研究最为透彻（图1）。保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌是乳酪发酵过程中的重要菌株，保加利亚乳杆菌几乎不具备氨基酸的合成能力，而嗜热链球菌具有除组氨酸以外所有与氨基酸合成相关的酶，保加利亚乳杆菌利用较强的蛋白水解能力为嗜热链球菌提供生长所需的氨基酸和短肽。大多数的保加利亚乳杆菌缺乏丙酮酸-甲酸裂解酶，不能生产甲酸、叶酸以及吡啶，而嗜热链球菌具有较高的丙酮酸-甲酸裂解酶活性，为保加利亚乳杆菌提供所需的物质。乳酸菌与酵母菌的互作关系既有协同促进作用，也有抑制作用。通常认为，在乳酸菌和酵母菌共发酵的体系中，乳酸菌代谢产生乳酸，降低环境pH至适合酵母菌增殖的酸性条件时，酵母菌开始酒精发酵，其代谢产物又促进乳酸菌的生长。Gobbetti等通过在MRS培养基中添加不同碳源（麦芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖）来研究乳酸菌和酵母菌之间的相互作用，研究结果显示，在添加了蔗糖的MRS培养基中，两菌共培养条件下，乳酸菌活菌数明显高于单菌培养时的活菌数，通过分析蔗糖分解的动力学曲线，认为其原因是酵母菌将蔗糖分解为葡萄糖和果糖，为乳酸菌提供稳定的碳源。Alvarez-Martín等利用共培养研究了12株酵母菌和4株乳酸菌的生长及相互作用，研究发现不同乳酸菌和酵母菌混合发酵不仅能促进各自细胞的增长，也可调控代谢产物的变化。在酵母菌存在情况下，乳酸菌可产生更多的乳酸，并且减少丙酸、乙酸和丙酮酸的产生，同时，挥发性代谢产物也随乳酸菌和酵母菌的不同组合有所变化。Lim等发现在酸性条件下（pH 2.5～4.0），酿酒酵母可能通过细胞表面和（或）细胞壁成分介导的或代谢物介导的细胞直接接触共聚合提高鼠李糖乳杆菌菌株的生存能力，且鼠李糖乳杆菌菌株活性增强效果受pH、鼠李糖乳杆菌和酵母浓度的影响。
图1乳酸菌和酵母菌相互作用机制
酵母菌和乳酸菌作为被人们熟知且广泛运用的微生物在食品发酵风味形成中起到十分重要的作用，两者在发酵上的联合作用日益受到人们的重视。乳酸菌与酵母菌之间既存在协同作用也存在拮抗作用，酵母菌所产生的二氧化碳、丙酮酸及氨基酸能够促进乳酸菌的活动，乳酸菌的生长也会受到溶脂酵母代谢产生的脂肪酸影响，而乳酸菌所产生的乳酸和4-羟基-苯乳酸对酵母菌的生长有一定的抑制作用。在酸面团中，酵母菌和乳酸菌是主要且活跃的微生物，酵母菌主要有酿酒酵母、毕赤酵母和面包酵母等，乳酸菌有植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌等。同型发酵和异型发酵的乳酸菌均在酸面团酸化过程中起作用，酵母菌和异型发酵的乳酸菌负责了酸面团的发酵。乳酸菌的发酵降低了酸面团的pH且提高了可滴定酸的含量，酸度的下降有利于蛋白酶和淀粉酶发挥作用，乳酸菌生产酸类、细菌素和抗真菌化合物抑制了其他细菌和真菌的生长，延长了酸面团的发酵周期，同时也利于保证微生物菌群的稳定性。乳酸菌可以通过麦芽糖磷酸化酶水解麦芽糖产生葡萄糖，而麦芽糖阴性酵母菌则能够利用乳酸菌外排的葡萄糖，麦芽糖阳性酵母菌对麦芽糖的利用只有在可用的葡萄糖和果糖被耗尽时才开始，发酵前期碳源竞争的避免使得酵母菌和乳酸菌都得以生长增殖。在酱油发酵中，Devanthi等分别以同时接种和顺序接种方式利用嗜盐四联球菌和鲁氏酵母制备酱油酱醪，同时检测总还原糖、总乳酸、乙酸、主要氨基氮和乙醇的含量，并通过SPME/GC-MS对风味成分进行分析，结果表明嗜盐四联球菌在鲁氏酵母存在下显着增殖，而随着酱醪pH增加鲁氏酵母的生长相对纯培养受到抑制，不同接种方式下的总还原糖、乙醇、乙酸、氨基氮含量无显着差异，而鲁氏酵母能够促进醇类的形成，并在与嗜盐四联球菌共同培养下产生更复杂的香气谱。
2.2 基于多组学技术的微生物互作机制
随着系统生物学技术的进步，利用多组学技术，多水平、多层次研究复杂的微生物间相互作用关系成为一种重要手段。基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学分别从DNA、RNA、蛋白质和代谢物四个水平揭示微生物在生命过程中的一系列变化，有助于全面深入地认识微生物间复杂的相互作用关系。Wang等利用转录组学方法研究了大豆固态发酵过程中纳豆枯草芽孢杆菌和动物双歧杆菌之间的相互作用关系。在共培养48h后，动物双歧杆菌的浓度比单培养提高了2.9倍。与纳豆枯草芽孢杆菌共培养下，动物双歧杆菌中有459个基因表达量上调，21个基因表达量下调，表达上调的基因涉及转运、复合碳水化合物和氨基酸代谢、DNA修复、氧化应激相关功能和细胞生长；与动物双歧杆菌共培养下，纳豆枯草芽孢杆菌中仅有3个表达上调的差异基因，而3115个差异基因表达下调，表达上调的基因集中于碳水化合物和氨基酸代谢。Yao等利用转录组学方法分析了嗜盐四联球菌与鲁氏酵母菌相互作用关系，研究结果表明，与嗜盐四联球菌共培养导致鲁氏酵母菌中72个基因表达上调，895个基因表达下调，上调的基因主要涉及蛋白质水解、细胞吸附等功能，下调的基因主要涉及氧化磷酸化、小分子物质代谢、DNA复制和修复等功能。为研究酱香型白酒酿造中地衣芽孢杆菌和酿酒酵母之间的相互作用，孟醒等构建了酿酒酵母纯培养及其与地衣芽孢杆菌共培养发酵体系，利用蛋白质组学的方法研究了共培养对酵母菌蛋白表达的影响，研究结果表明，地衣芽孢杆菌诱导了酿酒酵母胞内69个蛋白差异表达，主要涉及糖酵解过程、乙醇代谢过程、细胞壁稳定性调控及应激反应等。Li 等利用基因组学和代谢组学研究了微生物群落对普洱茶品质的作用，结果表明在早期阶段曲霉属是茶褐素的主要生产菌株，而在后期阶段毛霉属和酿酒酵母属也参与到茶褐素生产；假单胞菌和曲霉是甲氧基酚类物质的重要生产菌株；在醇类物质的生产中，曲霉在初期是主要的生产菌株，在后期芽孢杆菌、杉木菌、拉萨逊菌和李斯特菌共同在生产中起作用。这些组学技术的应用进一步揭示了群体微生物互作的生理机制，并为微生物的定向调控及应用提供理论指导。
3 微生物共培养在发酵食品生产中的应用
对传统发酵食品微生物群落结构的解析以及微生物相互作用关系的研究为从系统水平上理解其酿造机制，构建高效可控的多菌株发酵体系，实现产品高效、定向生产奠定了良好的理论基础。基于此，研究人员提出将功能微生物共培养应用于发酵食品生产中。微生物共培养在食品发酵上的优势逐渐被人们发掘并得到重视，尤其是近年来，其在改造传统发酵工艺、提升产品品质、缩短发酵周期和提高产品安全性能方面已有许多成功的报道（表2）。
表2微生物共培养在食品发酵生产中的应用
共培养在改善发酵食品的口感和香气方面有十分积极的作用，如Meng等将茅台酒曲中重要的菌株地衣芽孢杆菌和酿酒酵母按不同比例接种到高粱提取液后发酵，再对产品挥发性物质进行分析，结果表明，共培养对酿酒酵母的生长几乎没有影响，但对地衣芽孢杆菌的生长有一定的抑制作用；在共培养条件下，酿酒酵母产乙醇和风味化合物的量显着提高，风味化合物包括4种脂肪酸及其对应的2种酯类、1种萜烯和5种芳香族化合物，产品中同时另有16种风味化合物因地衣芽孢杆菌的加入而增加，可见共培养对发酵食品的风味有积极影响。梁如等在椒坯发酵过程中添加假丝酵母菌、鲁氏酵母菌和嗜盐四链球菌3种微生物进行共培养，发酵结束后，与自然发酵相比，假丝酵母和鲁氏酵母的加入均使椒坯中细菌生物量降低，且假丝酵母的加入利于真菌生物量的增加，鲁氏酵母则不利于真菌生物量的增加。由于嗜盐四链球菌所产生的有机酸具有抑菌作用，真菌的生物量降低。共培养则使总生物量和真菌量略有提高，同时使总挥发性组分含量提高了28.46%，其中醇类和酯类组分分别增加了38.09%和40.92%。在缩短发酵周期方面，刘超兰等将耐盐乳酸菌和耐盐酵母菌共同接种到郫县豆瓣的酱醅中，对陈酿8个月后的酱醅的挥发性组分进行分析，结果表明，其中十四烷酸、十六碳酸、棕榈酸、亚油酸等酯香成分显着增加，接近自然陈酿12个月的水平，因此共培养能够缩短食品发酵周期。此外，利用微生物共培养在提升产品安全性能方面也取得了一定效果。Wu等将植物乳杆菌和鲁氏酵母接种到白菜和萝卜腌菜中进行发酵，从发酵的第1～8 天，体系中的亚硝酸盐含量持续下降，而自然发酵组中亚硝酸盐含量先增长后小幅下降，表明共培养可以有效抑制酸菜中亚硝酸盐的形成，降低酸菜中亚硝酸盐的含量。
4 展 望
传统发酵食品微生物群落多样，相互作用关系复杂，微生物间通过彼此影响，改变个体的生长及发酵特征，进而改变微生物群体的整体结构与功能，最终影响发酵食品的品质和安全性能。因此，深入剖析微生物间相互作用关系是认识群体微生物功能的基础，将有利于进一步指导对微生物群落功能的定向调控，为利用共培养对功能微生物的强化及相关产品品质的提升奠定基础。这既有利于传承我国传统发酵食品酿造技艺，又有利于应用现代生物技术科学合理地对其进行改造和提升，真正做到对传统工艺的继承与发展。
全文刊登于《生物产业技术》第4期
