第一代测序技术主要是由Sanger等人发明的测序技术,他的发明第一次为人们开启了解读 生命遗传密码 的大门,Sanger本人也因此获得了诺贝尔奖。这种DNA末端终止法测序技术的 原理:主要通过在DNA聚合酶、模板以及放射性同位素标记物的引物、dNTP以及ddNTP的作用后发生延伸反应,基于 ddNTP的存在,接着形成长度不一 的DNA延伸片段;然后利用平板凝胶电泳,用4条电泳道,分离4个反应产物,随后就可以按顺序读出相应的DNA序列。在当时 ,测序过程主要依靠手工操作,难以自动化,并且极其依赖电泳技术,试剂消耗极大,极大限制了测序的通量。
为了进一步提高测序通量,对第一代测序技术进行改进,加速了高通量测序技术(high throughput sequencing)也就是第二代测序技术的诞生,其原理主要为:第一步先构建DNA模板文库,接着将DNA固定在芯片表面或微球表面进行PCR扩增,形成基因片段簇或由于PCR扩增所出现的球状物;最后,添加聚合酶反应,有时候是添加连接酶,结果通过CCD相机采集反应中产生的标记信号,从而获得DNA片段的序列。与第一代测序技术相比,第二代测序技术由于单次代测序结果产出量大,所以叫做高通量测序技术。第二代测试技术的出现,极大地推动了基因组层次研究的进展,之前让研究者望尘莫及的基因组测序工作,现在变的比较简单。但是,其缺点也日益凸显。最主要的是,第二代测序读长较短。这一明显缺点对序列拼接,组装以及注释等分析带来了很大的困难。
针对第二代测序技术读长短的缺点,依赖物理、化学、材料等学科发展和生命科学的融合改进,以长读长为特点的第三代测序技术即单分子技术(single-molecule methods)面世,其主要 原理是:在单一的由DNA分子组成的阵列上进行合成测序,这种技术可以大大增加独立分析的DNA片段的数目,并且可以不再进行昂贵的DNA扩增,因此,该技术使数据的产出量更高,最终将进一步降低测序的成本。在商业化中应用较好,使用比较广的是Pacific Biosciences公司的单分子实时测序仪SMRT
