发育生物学家一直以来最关心的问题，就是各种信号通路如何对胚胎发育和器官形成进行精确的时空调控。近年来，CRISPR相关的基因编辑技术为研究人的发育提供了很好的平台。例如近期，科学家发现激活素A（Activin A）可以诱导胚胎干细胞（ESC）分化为定形内胚层（definitive endoderm，DE）细胞【1】，这是通过Nodal-TGF-β信号通路实现的【2】。然而紧接而来的问题则是Nodal-TGF-β信号如何在ESC中同时起到保持干细胞多能性，和促进内胚层分化这两个似乎相互矛盾的作用。此外，使用激活素A促进分化的效率在不同干细胞系中也并不一致，说明人们对于该通路调控分化的机理仍有未知之处。
5月21日，来自纪念斯隆凯特琳的研究者DanweiHuangfu和来自约翰霍普金斯大学的Michael Beer共同在Nature Genetics杂志发表题为Genome-scale screens identify JNK–JUN signaling as a barrier for pluripotency exit and endoderm differentiation的文章。他们利用CRISPR/Cas技术筛选出调控DE分化的JNK-JUN通路，并阐释了了JNK-JUN通路是通过结合ESC启动子来进行调控的。
研究者设计了由7万6千个余gRNA组成的文库，将它们转入ESC，靶向全基因组的每个基因。在激活基因编辑之后，他们使用激活素A和CHIR99021（GSK3抑制剂）诱导ESC向DE分化。接着他们以SOX17基因的表达量为标准，使用FACS将分化和未分化的细胞分开。研究者通过比较两种细胞中各种gRNA的比例发现了37个正向调控因子（促进分化）和28个逆向调控因子（阻止分化），并依次确认了其中的绝大部分。
正向调控因子主要由DE转录因子、Nodal-TGF-β通路、WNT通路、Hippo通路等已知通路中的因子组成。然而在6个FDR<0.05的逆向调控因子中，有4个都处在JNK-JUN通路中，包括MEKK1、MKK4、MKK7和JUN。作为验证，研究者通过基因敲除和药物抑制使JNK-JUN通路失活，这也直接导致了DE的分化率大幅上升至90%以上。
JNK-JUN通路之前并未被认为是细胞分化的调控因子。因此研究者进一步探索了其调控的机理，尤其是它同Nodal-TGF-β-SMAD2/3通路的关系。研究者首先分析了SMAD2/3的ChIP-seq数据，发现在ESC中OCT4/NANOG的motif在SMAD2/3结合位点最为富集，而在DE中GATA6的motif最富集。接着研究者加入了JNK抑制剂（JNKi），并对JNKi细胞进行ATAC-seq测序。他们使用gkm-SVM工具比较了JNK抑制后染色质开放性上升和下降的位点，发现SMAD2/3常常与那些染色质开放性下降的位点结合。对SMAD2/6和GATA6的ChIP-seq显示，JNKi使得DE中那些开放性上升的位点结合了更多的SMAD2/6和GATA6因子。研究者据此推断，JUN的功能是稳定ESC增强子，而JNKi则使这些增强子失活。
研究者接着将注意力集中在ESC和DE的增强子上。分析显示JUN倾向于和OCT4、NANOG与SMAD2/3一起结合在ESC启动子周围。JNKi降低了ESC中被JUN结合的启动子区域的开放性，同时增加了DE中被JUN结合的启动子区域的开放性。因此JNKi导致了SMAD2/3因子的重新分布。同时那些在JNKi后开放性降低的区域附近，也常常存在分化后表达水平下降的基因。
综上，JNK-JUN通路的功能并不是直接抑制DE增强子。相反，JUN结合ESC启动子和SMAD2/3因子，JNK-JUN通路保护了ESC基因调控网络的稳定性。这项工作也揭示了CRISPR全基因组筛查在发育生物学研究中的价值。
原文链接：
/10.1038/s41588-019-0408-9
参考文献
1.D’Amour, K. A. et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cellsto definitive endoderm. Nat. Biotech. 23, 1534–1541 ().
2.Robertson, E. J. Dose-dependent Nodal/Smad signals pattern the early mouseembryo. Semin. Cell Dev. Biol. 32, 73–79 ().
