高方园, 焦丰龙, 张养军, 秦伟捷*, 钱小红*
色谱, , Vol. 37 Issue (10): 1071-1083
DOI: 10.3724/SP.J.1123..0
外泌体分离技术及其临床应用研究进展
本文亮点
外泌体是细胞通过胞吐过程分泌的一类粒径为30~200 nm的囊泡，其组成包括脂质双分子层以及其内部包裹的细胞来源的蛋白质、核糖核苷酸（RNA）和脱氧核糖核苷酸（DNA）等生物分子。作为一种细胞间交流的重要方式，外泌体在一系列生理和病理过程中起着至关重要的作用。由于体液环境复杂，加之自身体积小、密度低，外泌体的富集与分离对于其后续分析和功能研究至关重要。该文介绍了外泌体的研究策略、表征手段及生物学功能和临床应用研究进展，特别对外泌体的提取方法进行了详细介绍，并加以系统评述。
背景介绍
外泌体(exosomes)是一类由细胞分泌到胞外的囊泡, 最早由Pan[1]和Johnstone[2]在绵羊网织红细胞中发现并命名。随着研究的深入, 人们[3]发现包括血细胞、免疫细胞、癌细胞、干细胞等在内的几乎所有细胞都可以产生外泌体, 所产生的外泌体不仅存在于细胞培养液中, 也存在于血液、尿液、母乳、唾液、胸腔积液等体液中。与其他两种胞外囊泡(微囊泡和凋亡小体)相比, 外泌体在产生方式、尺寸、密度和内容物等方面存在明显差异。不同于微囊泡“出芽”的形成方式, 外泌体主要通过胞吐过程释放至细胞外:首先细胞膜向内凹陷形成早期核内体(early endosomes), 早期核内体进一步内陷形成多泡体(multivesicular bodies, MVBs), 其中一部分多泡体与溶酶体(lysosome)融合, 进而降解; 另一部分与细胞膜融合, 将其内部所包含的囊泡释放至胞外, 即为外泌体[4]。
外泌体具有独特的物理化学性质, 其直径为30~200 nm, 密度为1.13~1.19 g/mL, 组成包括细胞来源相关的脂质、蛋白质、RNA、DNA等物质, 在其表面连接有大量的糖链, 如甘露糖、聚乳糖胺和α-2,6-唾液酸等[5]。外泌体中常见的磷脂包括鞘磷脂、胆固醇、磷脂酰胆碱、神经酰胺、磷脂酰胆碱等。但是由于特殊的产生方式, 外泌体所含的脂质可能与来源细胞膜存在显着差异。例如, 与PC-3细胞相比, PC-3细胞外泌体中含有较高丰度的鞘糖脂、鞘磷脂、胆固醇和磷脂酰丝氨酸[6]。外泌体常见的表面蛋白质包括四跨膜蛋白(如CD63、CD9、CD81)、黏附蛋白(如L1CAM、LAMP2)、整合素和糖蛋白(如纤连蛋白)等[7,8], 而外泌体囊泡内蛋白质则与来源细胞内的蛋白质密切相关, 包含例如热休克蛋白(HSP70、HSP90)和细胞骨架蛋白(actin、tubulin、cofilin)等[9]。除此之外, 外泌体中还携带有来源细胞的miRNAs、mRNAs、non-coding RNAs、circular RNAs和DNA等遗传物质。外泌体的完整囊泡结构能够保护其内部生物分子不受体液中各种酶的影响从而保持其完整性和生物活性。例如, 外泌体中包含的mRNAs和miRNAs在进入受体细胞后仍具有翻译蛋白质、促进病毒感染等功能[10]。据估计, 单个外泌体含有约≤100拷贝数的蛋白质和≤10000拷贝数的核苷酸[11]。不同细胞来源的外泌体中既包含与细胞形成、结构和物质转运相关的共有成分, 也包含与来源细胞的生物功能相关的特异分子。如B淋巴细胞、树突状细胞、肥大细胞和肠上皮细胞来源的外泌体含有大量的主要组织相容性复合体蛋白质MHC class Ⅱ和MHC class Ⅰ, 血小板和T细胞来源的外泌体则包含诸如血管性血友病因子、穿孔素和颗粒酶等特殊蛋白质[12], 而癌细胞来源的外泌体表面可能含有肿瘤特异的蛋白质分子[13]。这类特异分子在外泌体介导细胞信号转导、参与生理病理过程中发挥至关重要的作用。
文章大纲
1
外泌体的研究策略
2
外泌体的提取方法
2.1 超速离心法
2.2 体积排阻色谱
2.3 超滤法
2.4 亲和法
2.5 基于聚合物的共沉淀法
2.6 外泌体提取新方法
3
外泌体的表征手段
4
外泌体的生物学功能及其临床应用
4.1 外泌体的生物学功能
4.1.1 正常细胞来源的外泌体
4.1.2 肿瘤细胞来源的外泌体
4.1.3 免疫细胞来源的外泌体
4.1.4 干细胞来源的外泌体
4.2 外泌体在疾病诊断中的应用
4.3 外泌体在疾病治疗中的应用
4.3.1 外泌体用于癌症免疫治疗
4.3.2 外泌体作为药物载体
●展望●
外泌体作为细胞间信息交流的重要介质, 既对维持机体的正常生命活动起重要作用, 也在肿瘤、免疫、组织修复等领域发挥独特的生物学功能, 因而受到广泛关注。随着研究的不断深入, 外泌体的各项功能逐渐被挖掘, 越来越多的分离提取技术不断涌现。但目前依然存在着一些重大问题与挑战, 例如不同细胞来源外泌体在机体内的作用机制尚不明确; 尚无一种方法能够同时实现外泌体快速、高效、高纯度、无损伤的提取, 难以满足目前科研和临床的需求。虽然如此, 随着分离和检测技术的不断开发、融合, 外泌体在不同领域的诸多潜能终将会被发掘。
参考文献
[1] Pan B T, Johnstone R M. Cell, 1983, 33(3): 967
[2] Johnstone R M, Adam M, Hammond J R, et al. J Biol Chem, 1987, 262(19): 9412
[3] Keller S, Sanderson M P, Stoeck A, et al. Immunol Lett, , 107(2): 102
[4] Suchorska W M, Lach M S. Oncol Rep, , 35(3): 1237
[5] Shao H, Im H, Castro C M, et al. Chem Rev, , 118(4): 1917
[6] Llorente A, Skotland T, Sylvänne T, et al. BBA-Mol Cell Biol L, , 1831(7): 1302
[7] Purushothaman A, Bandari S K, Liu J, et al. J Biol Chem, , 291(4): 1652
[8] Urbanelli L, Magini A, Buratta S, et al. Genes, , 4(2): 152
[9] Meldolesi J. Curr Biol, , 28(8): 435
[10] Valadi H, Ekström K, Bossios A, et al. Nat cell biol, , 9(6): 654
[11] Vlassov A, Magdaleno S, Setterquist R, et al. BBA-Gen Subjects, , 1820(7): 940
[12] Stoorvogel W, Kleijmeer M J, Geuze H J, et al. Traffic, 2002, 3(5): 321
[13] Vaidyanathan R, Naghibosadat M, Rauf S, et al. Anal Chem, , 86(22): 11125
（略）
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